基于細(xì)胞自噬對車前草多糖的免疫藥理機制研究.pdf

1、車前草最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是《中國藥典》（2015年版）收載的常用中藥，具有清熱解毒、祛痰利尿之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)車前草中含有多糖類、黃酮類、熊果酸及苷類等多種活性成分，具有鎮(zhèn)咳平喘、抗菌和抗氧化等作用。近期的一些研究發(fā)現(xiàn)，車前草的多糖成分—車前草多糖（Plantago asiatica Polysaccharide，PLP）在促進(jìn)動物機體免疫器官發(fā)育、免疫細(xì)胞增殖以及提高疫苗免疫抗體效價等方面都具有明顯的效果，但其免疫藥理

2、作用機理尚不明確。細(xì)胞自噬（Autophagy）是機體固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要組成部分，參與病原的清除、炎癥反應(yīng)以及抗原呈遞等方面的作用。研究發(fā)現(xiàn)，自噬信號調(diào)控途徑的mTOR（Mammalian Target of Rapamycin）調(diào)控途徑和mTOR不依賴性（Ⅲ-PI3K）調(diào)控途徑，同時也是免疫分子及藥物進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的有效途徑。近年來，一些中藥及有效成分如姜黃素、苦參堿、氨茶堿誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞發(fā)生自噬的研究，使細(xì)胞自噬成為了

3、探索中醫(yī)藥藥理作用機制的新途徑。本研究基于細(xì)胞自噬調(diào)控途徑以及細(xì)胞自噬與固有免疫的TLR4/NF-κB信號通路的交互作用，研究車前草多糖對細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用及其免疫藥理作用機制，擬明確車前草多糖的免疫藥理作用靶位，為車前草多糖成為一種新型免疫調(diào)節(jié)劑提供試驗依據(jù)。試驗主要結(jié)果及結(jié)論如下：
　　1．車前草多糖對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬的影響
　　試驗以LPS誘導(dǎo)Raw264.7巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬，分別以車前草多糖的低（25μg/mL

4、）、中（50μg/mL）、高（100μg/mL）三種不同劑量進(jìn)行干預(yù)，用MDC熒光染色檢測自噬體的聚積程度，用Western-blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平，和用熒光定量PCR檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的mRNA表達(dá)水平，研究車前草多糖對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。試驗結(jié)果顯示，車前草多糖使 LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬體熒光聚積增多；對LC3Ⅱ/Ⅰ比值及LC3 mRNA表達(dá)水平、Becli

5、n-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)作用。其中，車前草多糖中劑量干預(yù)組的LC3Ⅱ/Ⅰ比值在20h時顯著高于LPS組（P<0.01），LC3 mRNA表達(dá)水平在2h、16h、20h、24h時顯著高于LPS組（P<0.05）；車前草多糖高劑量干預(yù)組的LC3Ⅱ/Ⅰ比值在16h、20h、24h顯著高于LPS組（P<0.05或P<0.01），LC3 mRNA表達(dá)水平在2h、16h、20h、24h時顯著高于 LPS組（P<0.05）。車

6、前草多糖中劑量干預(yù)組的Beclin-1蛋白表達(dá)水平在16h、20h、24h時顯著高于LPS組（P<0.05或P<0.01），Beclin-1 mRNA表達(dá)水平在16h時顯著高于LPS組（P<0.05）；車前草多糖高劑量干預(yù)組的Beclin-1蛋白表達(dá)水平在16h、20h、24h時顯著高于LPS組（P<0.01），Beclin-1 mRNA表達(dá)水平在2h、8h、16h、20h顯著高于LPS組（P<0.05或P<0.01）。試驗結(jié)果表明，車

7、前草多糖能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的自噬體數(shù)量增加，上調(diào)LC3和Beclin-1的表達(dá)水平，對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬具有促進(jìn)作用。
　　2．車前草多糖對細(xì)胞自噬mTOR和Ⅲ-PI3K調(diào)控通路的影響
　　通過對細(xì)胞自噬mTOR和Ⅲ-PI3K調(diào)控通路的正向試驗及阻斷試驗，研究車前草多糖調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的分子機制。試驗以LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞發(fā)生自噬，并分別使用抑制劑—雷帕霉素（Rapamycin）和3-甲基腺嘌呤（3-MA）對mTOR

8、和Ⅲ-PI3K調(diào)控通路進(jìn)行阻斷，用Western-blot和熒光定量PCR技術(shù)檢測自噬調(diào)控通路相關(guān)分子mTOR、ULK1、Beclin-1、Ⅲ-PI3K的蛋白及mRNA表達(dá)水平。試驗結(jié)果顯示，LPS組與空白對照組相比，LC3Ⅱ/Ⅰ比值及LC3 mRNA表達(dá)水平顯著增高（P<0.01），mTOR蛋白及mRNA表達(dá)減少（P<0.05），ULK1的蛋白及mRNA表達(dá)增加（P<0.05）；Ⅲ-PI3K蛋白及mRNA表達(dá)增加（P>0.05），Be

9、clin-1的蛋白及mRNA表達(dá)顯著增加（P<0.05或P<0.01）。車前草多糖干預(yù)后，與LPS組比較，LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著增高（P<0.05），ULK1和Ⅲ-PI3K的蛋白表達(dá)水平增高但差異不顯著（P>0.05），Beclin-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著增高（P<0.05或P<0.01）。當(dāng)雷帕霉素抑制mTOR通路時，LC3Ⅱ/Ⅰ比值及LC3 mRNA表達(dá)水平較 LPS組顯著增高（P<0.05或P<0.01），其中LPS+Rap

10、a+PLP組顯著低于LPS+Rapa組（P<0.05或P<0.01）；ULK1的蛋白及mRNA表達(dá)水平較 LPS組無顯著差異（P>0.05），其中LPS+Rapa+PLP組的ULK1蛋白表達(dá)水平顯著高于LPS+Rapa組（P<0.05）。當(dāng)3-MA抑制Ⅲ-PI3K通路時，LC3Ⅱ/Ⅰ比值及LC3 mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著降低（P<0.01），其中LPS+3-MA+PLP組與 LPS+3-MA組之間無顯著差異（P>0.05）；Bec

11、lin-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著降低（P<0.05），其中LPS+3-MA+PLP組的Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著低于LPS+3-MA組（P<0.05）。試驗結(jié)果表明，車前草多糖可通過激活Ⅲ-PI3K通路促進(jìn)細(xì)胞自噬，其作用機制與上調(diào)ULK1和Beclin-1的表達(dá)有關(guān)。
　　3．車前草多糖在TLR4/NF-κB通路與自噬調(diào)控通路交互作用中的調(diào)節(jié)機制
　　通過對TLR4/NF-κB通路與自噬調(diào)控通路的正向

12、和阻斷試驗，研究車前草多糖在固有免疫的TLR4/NF-κB信號通路與自噬調(diào)控通路交互作用中的調(diào)節(jié)機制。試驗以LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞發(fā)生自噬，使用雷帕霉素和3-MA分別阻斷mTOR和Ⅲ-PI3K自噬調(diào)控通路，通過熒光定量PCR檢測TLR4/NF-κB通路中TLR4、MyD88、TRIF、NF-κB的mRNA表達(dá)水平、及Western-blot檢測NF-κB p65的磷酸化水平的變化；并用抑制劑BAY11-7082阻斷NF-κB通路

13、，用Western-blot和熒光定量PCR檢測自噬相關(guān)分子LC3、Beclin-1、Ⅲ-PI3K、mTOR的蛋白及mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，LPS處理Raw264.7細(xì)胞后，TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表達(dá)水平以及NF-κB p65磷酸化水平較空白對照組顯著增高（P<0.05或P<0.01）。經(jīng)車前草多糖干預(yù)后，TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表達(dá)水平以及NF-κB p65磷酸化水平較LPS組均有不同程

14、度的升高。當(dāng)雷帕霉素抑制mTOR通路時，NF-κB p65的磷酸化水平較LPS組顯著降低（P<0.01），其中LPS+Rapa組和LPS+Rapa+PLP組之間無顯著差異（P>0.05）；TRIF mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著增高（P<0.05或P<0.01），并且LPS+Rapa+PLP組顯著低于LPS+Rapa組（P<0.05）。當(dāng)3-MA抑制Ⅲ-PI3K通路時，NF-κB mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著增高（P<0.01），其中

15、LPS+3-MA+PLP組低于 LPS+3-MA組但無顯著差異（P>0.05）。當(dāng)BAY11-7082抑制NF-κB通路時，LC3Ⅱ/Ⅰ比值及LC3 mRNA表達(dá)水平較LPS組明顯降低，其中LPS+BAY+PLP組和LPS+BAY組之間無顯著差異（P>0.05）；mTOR的蛋白及mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著增高（P<0.05或P<0.01），其中LPS+BAY+PLP組和LPS+BAY組之間無顯著差異（P>0.05）；Beclin-1

16、的蛋白及mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著降低（P<0.05或P<0.01），其中LPS+BAY+PLP組的Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著低于LPS+BAY組（P<0.01）；Ⅲ-PI3K的mRNA表達(dá)水平較LPS組顯著降低（P<0.01），其中LPS+BAY+PLP組和LPS+BAY組之間無顯著差異（P>0.05）。研究結(jié)果表明，車前草多糖可通過協(xié)同激活TLR4/NF-κB信號通路促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的自噬，在自噬通路與TLR4/NF-κB通