聚磷相關(guān)基因的克隆、鑒定及高效聚磷工程菌株的構(gòu)建.pdf

1、水體的富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致水質(zhì)的惡化,水體功能的衰退,最終促使水體生態(tài)系統(tǒng)的失衡甚至崩潰,并且在自然條件下,水體富營(yíng)養(yǎng)化是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)和不斷加速的過程。近年來水體富營(yíng)養(yǎng)化已成為世界性的“生態(tài)癌”,在我國(guó)該問題尤為嚴(yán)重,由富養(yǎng)化引起的生態(tài)事件層出不窮?？扇苄粤姿猁}是導(dǎo)致自然水體富營(yíng)養(yǎng)化的兩大主因之一。因此如何高效、低成本的原位去除可溶性磷酸鹽已經(jīng)成為了全球性的研究熱點(diǎn)。
　　 本文以實(shí)驗(yàn)室分離得到的中華根瘤菌NP1(Sinorhizobi

2、um ap.NP1)為原始菌株,通過同源克隆首次獲得了Sinorhizobium ap.NP1中生物聚磷相關(guān)的腺苷酸激酶基因(adk)序列(登陸號(hào):GQ249079),該基因全長(zhǎng)579bp,編碼192個(gè)氨基酸,具有完整的閱讀框架。BLAST比對(duì)結(jié)果表明,NP1腺苷酸激酶與Sinorhizobium fredii NGR234腺苷酸激酶的核苷酸序列一致性為85％,氨基酸序列一致性為92％。對(duì)NP1 adk的基因產(chǎn)物進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)

3、在線模擬分析,NP1ADK的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)為α螺旋,同源比對(duì)結(jié)果表明adk基因產(chǎn)物的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)在不同菌株間有很高的相似性。
　　 NP1 adk基因產(chǎn)物不含有信號(hào)肽,結(jié)構(gòu)域分析顯示,NP1 ADK含有典型的Lid結(jié)構(gòu)域和AMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
　　 以pET21b為表達(dá)載體,E.coli BL21為受體菌,進(jìn)行了NP1 adk的原核表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明,NP1 adk基因的編碼產(chǎn)物為20KDa左右,證明腺苷酸激酶獲

4、得了有效表達(dá)。HPLC對(duì)ATP定量測(cè)定結(jié)果表明:重組菌株的ATP合成量約為對(duì)照菌株的1.3倍,證明了表達(dá)產(chǎn)物具有生物學(xué)活性,能增強(qiáng)ATP的生物合成。
　　 采用組成型啟動(dòng)子did加強(qiáng)adk和ppk基因的表達(dá),以克隆載體pBBR1MCS-3為原始載體,構(gòu)建NP1 adk、ppk基因增強(qiáng)表達(dá)的質(zhì)粒載體pBBR1MCS—DA-DP。采用電轉(zhuǎn)化的方法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原始菌株NP1中,獲得NP1重組菌株。重組菌株除磷實(shí)驗(yàn)表明:NP1重組菌株可