聚磷相關基因的克隆、鑒定及高效聚磷工程菌株的構建.pdf

1、水體的富營養(yǎng)化導致水質的惡化,水體功能的衰退,最終促使水體生態(tài)系統(tǒng)的失衡甚至崩潰,并且在自然條件下,水體富營養(yǎng)化是一個不可逆轉和不斷加速的過程。近年來水體富營養(yǎng)化已成為世界性的“生態(tài)癌”,在我國該問題尤為嚴重,由富養(yǎng)化引起的生態(tài)事件層出不窮?？扇苄粤姿猁}是導致自然水體富營養(yǎng)化的兩大主因之一。因此如何高效、低成本的原位去除可溶性磷酸鹽已經(jīng)成為了全球性的研究熱點。
　　 本文以實驗室分離得到的中華根瘤菌NP1(Sinorhizobi

2、um ap.NP1)為原始菌株,通過同源克隆首次獲得了Sinorhizobium ap.NP1中生物聚磷相關的腺苷酸激酶基因(adk)序列(登陸號:GQ249079),該基因全長579bp,編碼192個氨基酸,具有完整的閱讀框架。BLAST比對結果表明,NP1腺苷酸激酶與Sinorhizobium fredii NGR234腺苷酸激酶的核苷酸序列一致性為85％,氨基酸序列一致性為92％。對NP1 adk的基因產物進行了二級結構及三級結構

3、在線模擬分析,NP1ADK的主要二級結構為α螺旋,同源比對結果表明adk基因產物的二、三級結構在不同菌株間有很高的相似性。
　　 NP1 adk基因產物不含有信號肽,結構域分析顯示,NP1 ADK含有典型的Lid結構域和AMP結合結構域。
　　 以pET21b為表達載體,E.coli BL21為受體菌,進行了NP1 adk的原核表達。SDS-PAGE結果表明,NP1 adk基因的編碼產物為20KDa左右,證明腺苷酸激酶獲

4、得了有效表達。HPLC對ATP定量測定結果表明:重組菌株的ATP合成量約為對照菌株的1.3倍,證明了表達產物具有生物學活性,能增強ATP的生物合成。
　　 采用組成型啟動子did加強adk和ppk基因的表達,以克隆載體pBBR1MCS-3為原始載體,構建NP1 adk、ppk基因增強表達的質粒載體pBBR1MCS—DA-DP。采用電轉化的方法將該質粒轉入原始菌株NP1中,獲得NP1重組菌株。重組菌株除磷實驗表明:NP1重組菌株可