溶磷微生物分離、應(yīng)用及其相關(guān)基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、從適應(yīng)土壤定殖的溶磷微生物中篩選到一株適應(yīng)生產(chǎn)的溶磷真菌,并進(jìn)行了其土壤溶磷特性和溶磷機(jī)理初步研究,選取溶磷效果較好的菌株進(jìn)行了溶磷相關(guān)基因的克隆、表達(dá)和功能鑒定,取得以下主要結(jié)果:
　　 在磷酸三鈣為唯一磷源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上。以透明圈為指示,通過初篩和復(fù)篩,獲得效果穩(wěn)定的細(xì)菌23株,分屬6個(gè)屬11個(gè)種；真菌16株,其中有9株草酸青霉(Penicillium oxalicum),2株變幻青霉(Penicillium variab

2、ile),1株刺孢青霉(Penicillium aculeatum)、1株綠色木霉(Trichoderma viride)、2株黑曲霉(Aspergillus niger)、1株構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)。
　　 菌株對(duì)不同難溶磷(磷酸三鈣、磷酸鋅、磷酸鋁和磷酸鐵)的溶解能力實(shí)驗(yàn)表明:細(xì)菌對(duì)不同種類難溶磷溶解能力差異顯著,真菌的溶磷效果顯著高于細(xì)菌,16株真菌顯著降低PDB培養(yǎng)液的pH值,最低達(dá)到1.4

3、3,固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d能將各種難溶磷全部溶解。
　　 通過16株真菌在不同土壤中的定殖能力和釋放難溶磷的效果比較,篩選土壤中定殖和溶磷效果好的菌株。土培實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:真菌在土壤中具有較強(qiáng)的定殖能力；不同土壤中真菌的定殖能力差異顯著,同一種的真菌在土壤中的定殖能力也差異顯著。真菌釋放土壤難溶磷的能力與其土壤定殖的能力顯著相關(guān),菌株定殖能力越強(qiáng),釋放土壤難溶磷效果越好。其中,真菌Z33、Zh、ZC、Zh3、ZI1、Z15、zQ3

4、和Z30在土壤中定殖效果較好,28 d時(shí),菌株數(shù)量能達(dá)到起始值的10～48倍,有效磷含量增加44％～160％。
　　 通過微生物與作物、土壤的匹配性實(shí)驗(yàn),篩選適應(yīng)玉米生產(chǎn)的溶磷真菌,并開展了溶磷菌對(duì)土壤微生物多樣性影響分析。溶磷微生物與作物的匹配性實(shí)驗(yàn)表明:16株真菌在平板上對(duì)玉米根系分泌物的適應(yīng)性差異顯著,Z15+、Zh、ZQ3、ZI1、ZJ1和Z30能夠利用玉米的根系分泌物快速生長(zhǎng),并且能溶解平板中的磷酸三鈣。選取這6株真菌

5、進(jìn)行土培實(shí)驗(yàn),結(jié)果也證明Z15+、ZQ3、ZI1、Zh和Z30都能以玉米根系分泌物為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行繁殖,第21天時(shí),菌株數(shù)量達(dá)到起始的9.70～48.03倍,土壤有效磷增加了62.08％～147.55％。在盆栽玉米的土壤中,ZI1和Zh定殖的速度最快,菌劑ZI1和Zh處理后,玉米干重和濕重顯著增加,在大田試驗(yàn)中,菌株Zh連續(xù)2年都具有較高的增產(chǎn)作用,而菌株ZI1只在2010年的試驗(yàn)中具有較好的增產(chǎn)作用。因此本文獲得適應(yīng)大田玉米生產(chǎn)的溶磷真菌為

6、構(gòu)巢曲霉Zh。溶磷菌劑對(duì)土壤微生物的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的影響,總體趨勢(shì)為細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量比對(duì)照有所增加,土壤中微生物多樣性變化與土壤中細(xì)菌數(shù)量變化成正相關(guān),土壤中細(xì)菌數(shù)量越多,土壤微生物多樣性越高。
　　 選取具有較好增產(chǎn)效果的構(gòu)巢曲霉Zh和草酸青霉ZI1,對(duì)其產(chǎn)酸的種類,不同溫度條件下土壤溶液pH值的變化、菌株定殖能力以及土壤中不同級(jí)別難溶磷的轉(zhuǎn)化規(guī)律進(jìn)行研究,探討了溶磷真菌在土壤中溶磷機(jī)理和溶磷特性。利用離子色譜對(duì)菌株產(chǎn)酸

7、種類進(jìn)行分析,結(jié)果表明:構(gòu)巢曲霉Zh和草酸青霉Z11在PDB溶液中能夠大量產(chǎn)生乳酸和草酸,培養(yǎng)26 h時(shí),溶液中乳酸和草酸的含量分別達(dá)到了372.5μg／mL和593.9μg／mL。菌株Zh和ZI1在15、20和30℃土培條件下,都有很強(qiáng)的定殖能力,并能使土壤溶液的pH值顯著降低,土壤溶液pH值變化與菌株在土壤中定殖的規(guī)律一致。不同的溫度下,菌株Zh和ZI1對(duì)土壤中不同級(jí)別的難溶磷的轉(zhuǎn)化規(guī)律總體趨勢(shì)一致,土壤中Ca2-P、Ca8-P、A

8、l-P、Fe-P和Ca10-P形態(tài)的無(wú)機(jī)磷含量都發(fā)生了變化,菌株Zh轉(zhuǎn)化土壤中Ca8-P量較高,而菌株ZI1對(duì)Al-P、Fe-P轉(zhuǎn)化效率較高。菌株Zh和ZI1溶磷機(jī)理為菌株在土壤繁殖過程中分泌有機(jī)酸與鐵、鋁、鈣等離子螯合,從而使難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷。
　　 構(gòu)建黑曲霉Zh3和草酸青霉ZI1的cDNA文庫(kù),在磷酸三鈣為唯一磷源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上以透明圈為指示,篩選溶磷克隆子,結(jié)果從菌株Zh3和ZI1的cDNA文庫(kù)中分別篩選到攜帶溶磷相

9、關(guān)基因的克隆子60個(gè)和72個(gè),這些克隆子在第二代轉(zhuǎn)接后功能穩(wěn)定,確認(rèn)這些克隆子所攜帶的基因具有溶磷的功能。黑曲霉Zh3文庫(kù)中篩選的克隆子所攜帶基因序列全長(zhǎng)為1407bp,與Aspergillus niger CBS513.88和Aspergillus niger contig An07c0220的同源性達(dá)到98％,與其他菌的同源性低于80％,但目前還沒報(bào)到該基因在溶磷功能方面的研究,將該基因命名為pag T。草酸青霉ZI1文庫(kù)中篩選的克

10、隆子所攜帶基因序列全長(zhǎng)為1160bp,與Penicilliumchrysogenum Wisconsin54-1255和Aspergillus niger CBS513.88的同源性只有68％,與其他菌的同源性更低,表明該基因?yàn)橐粋€(gè)新的基因,將該基因命名為ppg T。
　　 分析溶磷相關(guān)基因ppq T和paq T的開放閱讀框,構(gòu)建重組表達(dá)載體,獲得轉(zhuǎn)化子,并分析轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生有機(jī)酸種類和溶液pH值的變化。草酸青霉ZI1中溶磷相關(guān)基因

11、ppg T開放閱讀框長(zhǎng)702 bp,蛋白長(zhǎng)233個(gè)氨基酸,該蛋白與Penicillium chrysogenum Wisconsin54-1255的Pc21g23580同源性最高,為59％,目前還沒有該類蛋白的功能研究報(bào)道,確定本文獲得的蛋白PPG-T為新的蛋白。黑曲霉Zh3中溶磷相關(guān)基因pag T開放閱讀框長(zhǎng)819 bp,蛋白長(zhǎng)333個(gè)氨基酸,該蛋白與Aspergillus niger CBS513.88的bax Inhibitor

12、family protein同源性達(dá)到100％,但該蛋白還沒有溶磷功能的報(bào)道,屬于該蛋白的新功能。將ppq T和paq T的開放閱讀框連接到pET28和pGEX表達(dá)載體中,構(gòu)建了4株轉(zhuǎn)化子,產(chǎn)生的乙酸和甲酸將難溶磷無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液的pH值降低到3.6左右,在LB培養(yǎng)中,4株轉(zhuǎn)化子不能將溶液的pH值降低,表明基因的表達(dá)需要難溶磷的誘導(dǎo)。ppq T基因在E.coli.DH5α中的溶磷機(jī)理是將葡萄糖氧化生成乙酸,溶解無(wú)機(jī)磷；而paq T基因在E.