匹諾塞林生物合成相關(guān)基因的克隆、功能鑒定及工程菌的構(gòu)建.pdf

1、黃酮類化合物是植物中種類最多、分布最廣的次級(jí)代謝產(chǎn)物家族，目前有超過(guò)9000種黃酮類化合物被發(fā)現(xiàn)。其具有較多藥理活性，例如抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、神經(jīng)保護(hù)等，此外，黃酮類化合物在化妝品、工業(yè)原料等方面也有重要的應(yīng)用價(jià)值，使得黃酮類化合物一直是研究熱點(diǎn)。根據(jù)結(jié)構(gòu)骨架，可以分為黃酮醇、黃酮類、黃烷酮類、異黃酮類、兒茶素類和花色苷類。
　　匹諾塞林是一種廣泛存在于植物中的二氫黃酮類化合物，具有很好的生物活性，如神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗氧化等

2、。在2009年，匹諾塞林被CFDA批準(zhǔn)為Ⅰ類注射新藥，主要用于治療急性腦卒中，現(xiàn)已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。匹諾塞林的良好成藥性使其合成方法備受關(guān)注。匹諾塞林可以通過(guò)化學(xué)合成、植物提取和合成生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行制備。合成生物學(xué)技術(shù)是一種環(huán)境友好的工程化生物技術(shù)，代表未來(lái)匹諾塞林的合成發(fā)展方向。匹諾塞林的生物合成途徑中有三個(gè)關(guān)鍵酶:對(duì)香豆酸輔酶A連接酶、查爾酮合酶、查爾酮異構(gòu)酶。由于查爾酮異構(gòu)酶具有空間選擇性，利用合成生物學(xué)技術(shù)制備的匹諾塞林為2

3、S構(gòu)型，單立體異構(gòu)體對(duì)藥物的申報(bào)上市具有很重要意義。
　　本論文還進(jìn)行了法呢基焦磷酸合酶的研究。其作為一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，可以催化IPP和DMAPP生成法呢烯焦磷酸(FPP)，而FPP既參與合成倍半萜類化合物，也參與合成三萜皂苷和甾體皂昔等化合物，即FPPS處于單萜和倍半萜生物合成途徑分支處，是異戊二烯生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。對(duì)法呢基焦磷酸合成酶的研究為虎眼萬(wàn)年青(Ornithogalum caudatum)中萜類天然藥物生物合成

4、途徑的重構(gòu)提供了必要的基因元件，為推動(dòng)萜類天然藥物合成生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究圍繞(2S)-匹諾塞林的合成生物學(xué)制備，從虎眼萬(wàn)年青中克隆得到了匹諾塞林生物合成途徑中的三個(gè)關(guān)鍵酶基因家族Osa4CL、OsaCHS和OsaCH1，進(jìn)行了功能鑒定，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建工程菌，獲得了具有立體異構(gòu)體的（2S)-匹諾塞林，并研究了其藥理活性。主要取得如下結(jié)果:
　　1.關(guān)鍵酶基因家族的克隆與表達(dá)
　　通過(guò)對(duì)虎眼萬(wàn)年青轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

5、、數(shù)據(jù)分析，通過(guò)提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，設(shè)計(jì)引物克隆得到
　　匹諾塞林生物合成途徑中三個(gè)關(guān)鍵酶基因家族Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI的unigene，其中Osa4CL家族含有7條unigene、OsaCHS家族含有3條unigene條和OsaCHI家族含有1條unigene，利用In-Fusion原理構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并進(jìn)行誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了Osa4CL1、Osa4CL2、Osa4CL3、Osa4CL4、Osa4C

6、L5、Osa4CL6、Osa4CL7、OsaCHS1、OsaCHS2、OsaCHS3和OsaCHI表達(dá)。
　　2.關(guān)鍵酶的功能鑒定
　　在一條代謝通路通中，只有一個(gè)未知功能酶，若驗(yàn)證該途徑是通暢的，則可以說(shuō)明該關(guān)鍵酶具有活性。本文通過(guò)構(gòu)建工程菌的方法對(duì)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)表達(dá)的關(guān)鍵酶進(jìn)行功能鑒定，發(fā)現(xiàn)Osa4CL1、OsaCHS2和OssaCHI具有功能。工程菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)波譜解析鑒定了結(jié)構(gòu)，特別是進(jìn)行了圓二色譜的檢測(cè)，產(chǎn)物為匹諾塞林，且

7、為單立體異構(gòu)體，是2S構(gòu)型。首次對(duì)微生物來(lái)源的(2S)-匹諾塞林進(jìn)行了藥理學(xué)活性檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。
　　3.工程菌的構(gòu)建及優(yōu)化
　　圍繞已構(gòu)建工程菌產(chǎn)量問(wèn)題，本文從以下幾點(diǎn)對(duì)工程菌進(jìn)行優(yōu)化:選取高活性關(guān)鍵酶、模塊化組裝和對(duì)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，即選擇紫花苜蓿來(lái)源的MsCH1，設(shè)計(jì)了三種模塊化組裝模式和對(duì)Osa4CL、OsaCHS和MsCHI進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。三種模塊化組裝模式中只有第一種具有催化活性，在對(duì)密碼子進(jìn)

8、行優(yōu)化后，產(chǎn)量提高了1.66倍。
　　4.法呢基焦磷酸合酶的研究
　　通過(guò)對(duì)虎眼萬(wàn)年青轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、數(shù)據(jù)分析，得到了1327 bp的法呢基焦磷酸合酶基因unigene，通過(guò)ORF分析發(fā)現(xiàn)有1044 bp開(kāi)放閱讀框，命名為OsaFPPS,通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其等電點(diǎn)是5.01，進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)其屬于植物類FPPS家族。通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳及western-blot檢測(cè)，在體外酶促反應(yīng)后由GC-MS法檢