高效聚磷菌的篩選、ppk基因的克隆及其應(yīng)用研究.pdf

1、水體富營養(yǎng)化是全球十大環(huán)境問題之一。氮磷尤其是磷的輸入是引起水體富營養(yǎng)化的關(guān)鍵因素。城鎮(zhèn)生活污水的排放是水體磷污染的主要來源之一。為解決磷污染所帶來的危害，在污水進入水體前進行有效處理，降低排放污水的磷濃度十分必要。目前世界各地大規(guī)模污水處理廠主要采用強化生物除磷工藝（EBPR），EBPR工藝具有污泥產(chǎn)生量少、不使用化學物質(zhì)和運行經(jīng)濟等特征。在EBPR系統(tǒng)中聚磷菌在磷的去除中起著至關(guān)重要的作用。但迄今為止，人們僅分離到Acinetoba

2、cter species、Microlunatus phosphorus Lampropedia spp.、Pseudomonasspp.等屬的為數(shù)不多的PABs，而且這些菌純培養(yǎng)時很少能表現(xiàn)出EBPR系統(tǒng)典型聚磷菌的厭氧特征，有關(guān)聚磷菌的工程化應(yīng)用尚無報道；同時，由于微生物學家和工程專家結(jié)合不緊密，加之EBPR系統(tǒng)本身的復雜性，對EBPR的微生物學機理和分子機理了解不多，導致EBPR的穩(wěn)定運行難以控制和整個生物聚磷研究進展不快。為此，

3、加大聚磷菌的篩選力度，對聚磷菌的聚磷特性和聚磷關(guān)鍵基因，對聚磷菌的工程化應(yīng)用進行研究十分必重要。
　　 本文以高效聚磷菌聚磷機理研究為主線，從高效聚磷菌的篩選著手，系統(tǒng)研究了高效聚磷菌的生物學特性、聚磷特性、與聚磷相關(guān)的ppk基因、高效菌株GM6的定殖及其強化廢水生物除磷能力探索了GM6的工程化應(yīng)用前景，構(gòu)建了國內(nèi)生物除磷研究的技術(shù)平臺，取得了目前國內(nèi)污水強化生物除磷基礎(chǔ)研究和應(yīng)用領(lǐng)域較為豐富的研究成果。
　　 一.聚磷

4、菌的篩選及生物學特性
　　 改進了高效聚磷菌的篩選方法，篩選出了四株聚磷能力遠高于國外報道的野生菌株聚磷水平的高效聚磷株：采取大通量高流量的原則，采用平板梯度稀釋涂布、poly-P和PHB染色和藍白斑篩選獲得初選聚磷菌25株；經(jīng)好氧和厭氧培養(yǎng)確定了四株高效聚磷菌GM1、GM6、GM18和GM21，選擇GM1和GM6作為研究材料。經(jīng)生理生化鑒定和16S rDNA序列分析和同源性比較，GM1被初步鑒定為弗氏檸檬酸桿菌（Citroba

5、cler freundii）；GM6被初步鑒定為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。
　　 GM1在合成廢水中生長時，最適初始pH為7.0，最適生長溫度為30℃，當初始pH值大于8.5或小于5.5時或當溫度小于5℃或大于33℃時生長較慢；GM6在合成廢水中培養(yǎng)時，最適起始pH為6.5，最適生長溫度為27℃，當初始pH值大于8.0或小于5.0時，或當溫度小于5℃或大于37℃時生長較慢；裝液量對GM1和GM6生長影

6、響不大。
　　 二.GM1和GM6的聚磷特性
　　 GM1和GM6純培養(yǎng)時表現(xiàn)出了典型PABs的特征，為生物除磷研究提供了寶貴的材料：GM1和GM6在合成廢水中培養(yǎng)時，除磷最適初始pH值分別為6.5和7.0，當pH值小于5.5或大于7.5時，除磷能力均下降。GM1和GM6的最適除磷溫度為20℃和27℃；當溫度大于30℃或小于10℃時，GM1除磷效果明顯變差；當溫度大于33℃或小于5℃時，GM6的除磷效果明顯變差。GM1和

7、GM6對合成廢水、MOPS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基及YG培養(yǎng)基的好氧磷去除率分別在60％-89.6％和63％-96.6％之間（對照菌E.coli的去除率在13.6％-30.8％之間）。GM6的聚磷和放磷能力更強。當以乙酸為底物好氧培養(yǎng)時：GM1和GM6體內(nèi)能聚集類脂粒PHB，菌體PHB濃度上升與乙酸的濃度下降呈負相關(guān)；GM1、GM6厭氧培養(yǎng)時，底物乙酸濃度下降與菌體PHB的上升和磷濃度的增加呈負相關(guān)；在起始1h內(nèi)乙酸的吸收及磷的釋放速度較快，

8、隨著乙酸的吸收和poly-P的分解，上清液中乙酸濃度下降，磷的濃度上升，兩者呈負相關(guān)。
　　 三.GM6（Pseudomonas putida）聚磷酸鹽激酶基因ppk的克隆及表達
　　 國內(nèi)首次克隆了聚磷菌的ppk基因，對ppk基因進行了表達，表達菌株的除磷效率較高。本研究根據(jù)ppk基因的保守區(qū)設(shè)計引物，從GM6的總DNA中擴增到ppk基因的528bp的片段，隨后采用一種新型的擴增未知序列的PCR技術(shù)SEFA-PCR擴增

9、片段的上下游基因序列，將擴增的片段和擴增的上下游序列進行拼接，用Omiga軟件進行開放閱讀框分析，預(yù)測ppk基因全長為2220bp。其上游為HemB基因，長度可能為1119bp。將GM6的ppk基因序列與其它已報道的ppk基因進行同源性比較，GM6與Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas aeruginosa PAO1、Pseudomonas syringae、Klebsiella aerogenes

10、、Neisseria meningitidis、Acinetobactersp.ADP1和Escherichia coli K12-MG1655在核對苷酸水平的同源性分別為82％、79％、84％、45％、63％、53％和22％；與Pseudomonas putida KT2440、Acinetobacter.sp.ADP1、Escherichia coli K12-MG1655、Neisseria meningitidis MC58和P

11、seudomonas aeruginosa PAO1在氨基酸水平的同源性分別為89％、58％、33％、50％和80％。
　　 構(gòu)建的表達菌株E.coli BL21（DE3）/pET29a-ppk經(jīng)IPTG誘導3h時，獲得了ppk基因的表達產(chǎn)物，其分子量約81 kDa。表達菌株E.coli BL21（DE3）/pET29a-ppk12h的磷去除率高達80％（而對照菌株磷去除率僅為18％），遠高于國外報道的40％的磷去除率。表明pp

12、k基因在E.coli中的過量表達，導致了E.coli菌體中poly-P的大量聚集，從而使得培養(yǎng)基中的磷酸鹽大量的去除。
　　 四.高效聚磷菌GM6在活性污泥中的定殖及強化生物除磷應(yīng)用研究
　　 首次將高效菌株進行了工程應(yīng)用，獲得了快速強化廢水生物除磷的能力。利用三親接合對高效聚磷菌GM6進行標記，獲得gfp基因標記菌株GMTR。試驗表明，應(yīng)在厭氧起始時投加菌株，當接種量小于1％時，GMTR投菌后難以獲得生長優(yōu)勢；接種量達

13、到2％時，在裝置運行12個循環(huán)后，按2％-7.5％四種不同的接種比例投菌時污泥中GMTR的比例相差不大。因此，實際投菌時，確定比例為2％。GMTR在R2中的定殖情況是：在R2的污泥中檢出了GMTR，而對照R1污泥中在抗性平板上培養(yǎng)時末檢出。投加GMTR至R2后，R2運行21d時，GMTR的比例升至9.2％，GMTR的菌數(shù)已占據(jù)優(yōu)勢。投加GMTR菌株后，磷的去除率逐漸提高，運行21d時磷的去除率升至96％，28d后出水濃度穩(wěn)定在0.2 m

14、gL-1左右。運行21d時，裝置R2的厭氧和好氧污泥具備了EBPR的典型特征，厭氧1h，能快速放磷除有機物，好氧2h能有效除磷。因此，投加GM6能快速啟動和恢復強化生物除磷能力。選擇除磷能力較差的生活污水處理設(shè)施，利用GM6來強化其除磷能力，按2％比例投菌，投菌6d后，出水磷濃度逐漸下降，至25d時，出水磷濃度小于0.5 mg L-1，磷的去除率達96.8％。因此，GM6強化生物除磷效果顯著。
　　 五.影響EBPR系統(tǒng)生物除磷

15、的主要因素
　　 研究了進水乙酸濃度、厭氧生境、進水pH、好氧溶氧濃度及污泥泥齡對EBPR系統(tǒng)除磷效果的影響。厭氧45min時，釋磷量隨著進水中乙酸比例增加逐漸增大，僅以葡萄糖為碳源時釋磷量僅為2.25 mgL-1，乙酸比例為15％時釋磷量為16.69 mg L-1，乙酸比例大于30％時釋磷量基本不變；厭氧120min時，進水乙酸比例對于磷釋放量影響不大。過高的厭氧攪拌轉(zhuǎn)速對厭氧釋磷有影響，當轉(zhuǎn)速過高時磷釋放量下降。對系統(tǒng)釋磷而

16、言，最適pH6.5，當進水pH大于7.0或小于6.0時，磷釋放量均下降，當pH大于7.5時，磷的釋放量大幅下降。對系統(tǒng)磷去除率而言，進水最適pH為6.5，當進水pH超過7.0時，系統(tǒng)對磷的去除效率迅速下降，當pH值為8.0時的磷去除率僅為39.7％，系統(tǒng)失去了強化生物除磷能力。曝氣強度對出水中CODcr濃度的影響較小，但其對出水磷濃度影響較大，當曝氣強度使DO達到2.10 mg L-1時，出水磷濃度下降到0.26mg L-1的水平。污泥