植物病毒病害人工miRNA自動應(yīng)答防治技術(shù).pdf

1、植物病毒病常導(dǎo)致植物生長發(fā)育異常，嚴(yán)重時可導(dǎo)致植物的死亡，威脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。近年來，利用人工miRNA（artificial microRNA，amiRNA）防治植物病毒病的技術(shù)研究，已經(jīng)取得許多重要成果。人工miRNA技術(shù)主要是利用天然miRNA能夠降解目標(biāo)靶基因的特性，構(gòu)建能夠降解病毒基因的amiRNA，從而達(dá)到控制病毒病的效果。這些研究在構(gòu)建人工miRNA載體時使用的啟動子大多為組成型強(qiáng)啟動子，不僅增加了受體植物的基因表達(dá)負(fù)荷，還常

2、導(dǎo)致植物內(nèi)源miRNA的加工系統(tǒng)的飽和，影響受體植物生長發(fā)育。所以，要建立高效的植物抗病體系，需要進(jìn)一步探明植物和病毒互作的分子機(jī)理。因此，本實驗以模式植物煙草及其三種RNA病毒為試材，研究在病毒侵染過程中，煙草基因的表達(dá)變化，試圖找到被病毒特異誘導(dǎo)的啟動子。與此同時，對煙草天然miRNA的功能進(jìn)行驗證。旨在研究在病毒特異誘導(dǎo)的啟動子下，以煙草中的天然miRNA為骨架構(gòu)建的amiRNA防治病毒病的效果，為植物病毒病防治研究提供理論依據(jù)。

3、
　　本實驗利用3種RNA病毒(煙草花葉病毒，Tobacco mosaic virus，TMV；黃瓜花葉病毒，Cucumber mosaic virus，CMV和馬鈴薯Y型病毒，Potato virus Y，PVY）、2種非生物逆境(4oC、150 mM NaCl)和2種逆境信號物質(zhì)（1 mM茉莉酸，methyl jasmonic acid，MeJA和1 mM水楊酸，salicylic acid，SA）處理普通煙草，定量分析可能受

4、病毒誘導(dǎo)的10個煙草基因表達(dá)量的變化，試圖找到受病毒高效誘導(dǎo)的煙草基因。定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3種RNA病毒接種下和SA處理后，候選基因06G表達(dá)水平顯著升高，但在其它逆境處理下表達(dá)變化不顯著。進(jìn)一步分析TMV侵染后不同時間段06G表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示，06G表達(dá)水平能夠被快速激活，接種6 h后，06G表達(dá)水平即能達(dá)到對照的500倍，而且這種高水平的表達(dá)能夠一直維持20 d。通過以上結(jié)論我們推測候選基因06G的啟動子受病毒特異誘導(dǎo)。

5、>　　利用染色體步移技術(shù)克隆了06G轉(zhuǎn)錄起始位點上游的1967bp序列，并通過在線分析軟件PLANTPAN找到與病理相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點WBOXATNPR1。實驗中將06G啟動子連接報告基因GUS，分別為06GP1215:GUS和06GP1967:GUS，分段研究06G啟動子功能。結(jié)果顯示06GP1215:GUS在瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)實驗中，在1mM SA作用下GUS表達(dá)水平比對照升高20倍。但是，染色分析未檢測到GUS產(chǎn)物形成的藍(lán)色斑

6、點。06GP1967:GUS瞬時表達(dá)結(jié)果顯示，在未經(jīng)SA處理的GUS表達(dá)水平為對照的40倍，而在1mM SA處理下導(dǎo)致基因表達(dá)升高200倍。且在染色分析GUS在瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)中的活性實驗時，都有大片的藍(lán)色區(qū)域生成。實驗說明，06G的1215bp長度的啟動子序列不具有完整的功能，只能微弱啟動GUS的表達(dá)，而06G的1967bp長度的啟動子序列具有顯著的功能，并可以在SA處理下驅(qū)動報告基因GUS的高量表達(dá)，與前面的定量分析實驗結(jié)果相映。

7、綜上所述，推測06GP1967啟動子受病毒誘導(dǎo)啟動。
　　為了獲得構(gòu)建煙草病毒自動應(yīng)答體系，需要獲得具有正常功能的煙草天然miRNA。本研究通過生物信息學(xué)方法，預(yù)測了可能具有生物學(xué)功能的煙草 miRNA，找到煙草中的天然miRNA167前體序列。我們發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miRNA167的轉(zhuǎn)基因煙草植株，其靶基因ARF8表達(dá)水平受到明顯抑制。形態(tài)觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株雖然葉片黃化，但是可以正常的開花結(jié)果。本實驗找到了可以被病毒特異誘導(dǎo)的高