NtWRKY40與人工miRNA及asODN技術(shù)在植物抗病毒中的應(yīng)用.pdf

1、分類(lèi)號(hào)：?jiǎn)挝淮a：10364密級(jí)：學(xué)號(hào)：13720256安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文NtWRKY40與人工miRNA及asODN技術(shù)在植物抗病毒中的應(yīng)用TheApplicationofNtWRKY40amiRNAasODNTechnologyinPlantResistancetoVirus研究生：程春玲指導(dǎo)教師：魏書(shū)合作指導(dǎo)教師：申請(qǐng)學(xué)位門(mén)類(lèi)級(jí)別：農(nóng)學(xué)碩士專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)：茶學(xué)研究方向：生物技術(shù)與分子生物學(xué)所在學(xué)院：茶與食品科技學(xué)院答辯委員

2、會(huì)主席：2016年6月摘要植物病毒病害，防治上十分困難。植物病毒侵入寄主植物后，病毒粒子能夠抑制植物中參與生長(zhǎng)及形態(tài)建成相關(guān)基因的表達(dá)，從而對(duì)植物造成嚴(yán)重的損傷。在這一過(guò)程中，病毒侵染可迅速啟動(dòng)植物的抗逆反應(yīng)。本文從煙草NtWRKY40轉(zhuǎn)錄因子和amiRNA（artificialmicrNA，amiRNA）兩個(gè)方面，研究了NtWRKY40在煙草防御煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）侵染過(guò)程中的作用，應(yīng)用amiR

3、NA技術(shù)抑制病毒表達(dá)以及反義寡核苷酸反義寡核苷酸（Antisenseoligonucleotide，asODN）在篩選抗病毒amiRNA成熟序列中的作用。近年來(lái)，利用人工miRNA防治植物病毒病的技術(shù)研究，已經(jīng)取得許多重要成果。人工miRNA技術(shù)主要是利用天然miRNA能夠降解目標(biāo)靶基因的特性，以改變其成熟序列，構(gòu)建出能夠沉默目的基因的小RNA。這種技術(shù)以其特異性、高效性受到了普遍的關(guān)注，在動(dòng)植物代謝工程、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控以及抵抗外源病毒等

4、方面起著重要的作用。反義寡核苷酸（asODN）對(duì)靶標(biāo)序列的識(shí)別具有特異性與專(zhuān)一性，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于基因功能的分析。asODN技術(shù)對(duì)基因的表達(dá)具有抑制作用，因此，我們希望將asODN技術(shù)拓展到對(duì)amiRNA成熟序列的篩選應(yīng)用中，尤其是對(duì)抗病毒amiRNA的篩選。如果可行，將會(huì)推進(jìn)現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。本研究結(jié)合已有的報(bào)道及生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)病毒侵染煙草后會(huì)誘導(dǎo)NtWRKY40基因高表達(dá)。為確定該基因功能，本研究將NtWRKY4

5、0基因連接到植物雙元表達(dá)載體pBI121上，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，獲得35S::NtWRKY40轉(zhuǎn)基因植株，以探究NtWRKY40對(duì)病毒侵染的響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)篩選共獲得NtWRKY40過(guò)表達(dá)植株的7個(gè)株系，即W1～W7。此外，本實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯Y型病毒（PotatovirusY，PVY）為實(shí)驗(yàn)材料，以其外殼蛋白基因（PVYCP）為靶基因，以煙草天然miR167e為骨架，通過(guò)重疊PCR獲得amiR167PVY片段，將其連接到植物雙元表達(dá)載體

6、pBI121上。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，獲得35S::amiR167PVY轉(zhuǎn)基因植株，預(yù)期培育出抗馬鈴薯Y型病毒的植株，以實(shí)現(xiàn)對(duì)植物病毒病的自動(dòng)應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株的三個(gè)株系，即PVY1、PVY2和PVY3。結(jié)果顯示：野生煙草在病毒侵染后9d，NtWRKY40的表達(dá)量顯著升高，而NtWRKY40過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草在病毒侵染后，病毒相關(guān)基因的表達(dá)高于野生型對(duì)照，且與染病程度成正相關(guān)，這說(shuō)明過(guò)表達(dá)NtWRKY40增加了植株對(duì)病毒的