分光光度計(jì)的使用

1、分光光度計(jì)的使用,,主要內(nèi)容,１、分光光度法的概念２、分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)與原理３、分光光度計(jì)的使用４、實(shí)驗(yàn)操作（CuSO4溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制）,分光光度法的概念,分光光度法：是利用物質(zhì)特有的吸收光譜，進(jìn)行物質(zhì)鑒定及測定其含量的一種分析技術(shù)。也稱為吸收光譜法。是光譜分析技術(shù)中最常見的一種，應(yīng)用最多的是紫外及可見分光光度法。特點(diǎn)：靈敏、精確、快速和簡便。應(yīng)用：生物化學(xué)微量物質(zhì)定量分析測定研究中廣泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白質(zhì)，核

2、酸，酶等的快速定量檢測。 光譜范圍：200～1000nm 。,分光光度法的概念,紅外分光光度計(jì):大于760 nm的紅外光區(qū) 可見光分光光度計(jì):400～760 nm的可見光區(qū)紫外分光光度計(jì): 200～400 nm的紫外光區(qū),分光光度計(jì)的分類,,722E可見分光光度計(jì),,722E可見分光光度計(jì),,分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu),光源,單色光器,吸收池,檢測 系統(tǒng),,,,,鎢絲燈氫燈氘燈,棱鏡衍射光柵,玻璃比色杯石英比色杯,硒光電

3、池光電管光電倍增管,,當(dāng)一束單色光透過溶液時(shí),部分被吸收,部分被反射,部分被透過,Ir,Ia,I,出射光,I,比色皿 吸收杯,,反射光,Ir,Ia,吸收光,分光光度計(jì)基本原理,Ｉ/ I0表示光線透過溶液的程度,稱為透光度,用T表示；－IgT表示溶液對(duì)光線的吸收程度，用吸光度（A）表示。即,←L →,Lambert-Beer定律（光吸收定律）,Lambert定律：A＝K1L Beer定律：A＝K2C Lambert-Be

4、er定律：當(dāng)一束單色光垂直通過一均勻的溶液時(shí)，溶液的吸光度A，與溶液的濃度C及溶液的厚度L成正比。即A＝KCL其中：A－吸光度 K－為消光常數(shù)，表示物質(zhì)對(duì)光線吸收的能力，受物質(zhì)種類和光線波長的影響 C－溶液的濃度 L－溶液的厚度,,Lambert-Beer定律的應(yīng)用,1、利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測定物的含量 用一已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和一個(gè)未知濃度的待測溶液同樣處理顯色，測定吸光度，根據(jù)Lambert

5、-Beer定律得：A1=K1C1L1 A2=K2C2L2 因?yàn)?K1=K2 L1=L2 所以,C2=,Lambert-Beer定律的應(yīng)用,2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測定物含量 先配制一系列已知濃度的測定物溶液，按要求方法處理顯色，在最大吸收波長（λmax）處讀取各管的吸光度，以各管吸光度A為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度C為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后進(jìn)行測定時(shí)，待測樣品以相同條件在λmax處讀取吸光度，從標(biāo)

6、準(zhǔn)曲線上即可查得該待樣品的濃度。,0,722E分光光度計(jì)使用,基本操作：（示教） 通電→儀器自檢（ BLA ） →預(yù)熱20min →設(shè)定波長→方式設(shè)定（MOOD → T（或A） →儀器調(diào)“0.000”(將遮光杯）置入光路，在T方式下按“%T”鍵， →儀器自動(dòng)校正后顯示“0.000 →參比液調(diào)“0.000”A →樣品測定→讀取“A”。,722E分光光度計(jì)使用,注意事項(xiàng)：1、預(yù)熱----保證儀器準(zhǔn)確穩(wěn)定；2、比色皿的清潔-

7、---待測液潤洗、沖洗；3、比色皿配套----比色皿不能隨意；4、比色皿內(nèi)盛液體量---- 2/3 ，有液體，應(yīng)用擦鏡紙拭干，以保證光路通過時(shí)不受影響；5、拿放比色皿----應(yīng)持其“毛面”，杜絕接觸光路通過的“光面”；6、溶液濃度要適當(dāng)：吸光度讀數(shù)處于0.1～0.7范圍內(nèi)為宜，否則誤差較大，要適當(dāng)調(diào)整濃度。7、分光光度計(jì)連續(xù)使用一般不超過2h。,實(shí)驗(yàn)操作,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：CuSO4溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制操作步驟：1、用30%CuSO