儀器分析中的樣品處理

1、儀器分析中的樣品處理,中國分析測試協(xié)會 汪正范 Tel: (010)68512283Email: zfwang@caia.org.cn,儀器分析的四個基本程序,樣品的采集樣品的處理－分析試樣的制備上機分析數(shù)據(jù)處理,樣品處理的目的,將微量或痕量的欲測組分富集將干擾欲測組分的物質去除將無法被儀器分析的欲測組分轉化成可被儀器分析的物質,樣品處理在儀器分析中的必要性和重要性,分析樣品必須滿足所用分析儀

2、器的要求樣品處理將直接影響分析結果的可靠性和準確性整個分析過程中樣品處理花費的時間和精力最多,樣品處理應遵守的原則,采集的樣品要能滿足分析測試的目的，采集的樣品要有代表性，故在采樣的時間和地點，采樣的方法，采樣的量等方面作充分考慮。,,采樣裝置應保證采樣時樣品組成不發(fā)生變化。樣品處理前應首先了解分析測試的目的和欲測組分的物理、化學性能，對樣品的基本情況(如：物理性能、化學組成等等)也應有所了解，以便選擇適當?shù)摹⒑侠淼奶幚矸椒ā?/p>

3、,樣品處理過程中要防止和避免欲測組分發(fā)生化學變化，如必須將欲測組分進行轉換時，所使用的化學反應必須是已知的和能定量完成的。樣品處理過程中要防止和避免欲測組分的沾污或丟失，在處理過程中應盡可能減少無關物質的引入。,樣品處理所使用的方法應盡可能簡單易行，所使用的裝置尺寸應與處理的樣品量相適應。樣品處理時應同時處理2個或2個以上平行樣品，并帶一個空白，用以檢查樣品處理過程中是否存在問題。,樣品的采集方法,氣體樣品的采集 直接采集：

4、剛性容器采用預抽真空法采樣，柔性容器采用泵 采樣。 富集采集－固體吸附法、溶液吸收法、冷阱收集法。液體樣品的采集 直接采集：可直接用棕色玻璃瓶采集，樣品灌滿并溢出后封好，瓶中不應有氣泡，需要時應加適當?shù)谋４鎰?富集采集：吸附劑吸附。,固體樣品的采集 直接采集：考慮樣品的均勻性和代表性，采樣量要大些，然后進行縮分。大氣中懸浮顆粒物樣品的采集 根據(jù)所需采集顆粒物大小選擇適當?shù)臑V膜或濾筒采集

5、。,樣品處理的常用技術（方法）,灰化和消解 主要用于有機物中金屬元素的分析，通過高溫氧化或強氧化劑（如濃硫酸、硝酸、高氯酸、王水等等）氧化的方法將有機物中的大量碳除去。酸溶、堿溶和熔融 利用酸溶、堿溶或熔融的方法，將固體樣品或灰化和消解后的產物轉化為溶液，以便儀器分析或進行下一步的處理。,,萃取 將樣品中欲測組分抽提到另一相中，使其與干擾組分分離，并可同時進行富集。可

6、分為液相萃取—將固體、液體或氣體樣品中欲測組分抽提到溶劑中；固相萃取—將液體或氣體樣品中欲測組分吸附在固體上；氣相萃?。斂占夹g）—將固體或液體樣品中欲測組分抽提到氣體中；超臨界流體萃取—將固體樣品中欲測組分抽提到超臨界流體中。,蒸餾 利用欲測組分與干擾組分的沸點不同而進行分離，亦可同時進行富集。可分為簡單蒸餾、分餾（精餾）、減壓蒸餾和水汽蒸餾等。,沉淀、結晶和重結晶 利用欲測組分與干擾組分在

7、不同溶劑中的溶解度不同而進行分離，亦可同時進行富集?？蓪⒂麥y組分沉淀，干擾組分留在溶液中；亦可將干擾組分沉淀，欲測組分留在溶液中?？衫酶淖內芤旱臏囟?、濃度、pH值、溶劑的組成來改變欲測組分和干擾組分的溶解度，使其分離；亦可加入某些物質，使欲測組分或干擾組分沉淀或共沉淀（結晶或共結晶）而得到分離?？衫弥亟Y晶的方法得到很純的化合物，以便利用某些儀器進行準確的結構分析。,膜分離 利用欲測組分與干擾組分對不同膜的透

8、過性不同而分離。其分離過程可分為滲析、超濾和電滲析。膜分離也被稱為膜萃取。衍生化 利用已知的、能定量完成的化學反應，將不能被儀器分析或檢測的欲測組分轉化成可被儀器分析或檢測的物質，或將不能與干擾組分分離的欲測組分轉化成能分離的物質使兩者分離。,熱解吸 利用控制加熱速度和溫度的方法使欲測組分從固體樣品或固相萃取所用的固體吸附劑中解吸出來，從而與干擾組分分離。熱裂解 主要用于高分子化合物分析

9、，通過控制加熱速度和溫度使高分子化合物發(fā)生分解，生成小分子碎片，分析這些分解產物，推斷原高分子化合物的組成和結構。,電解 利用欲測組分與干擾物質的電解電位不同，通過電解的方法將欲測組分與干擾物質分離，并可以進行富集。如在作極譜分析或庫侖分析時，可通過電解進行預分離和預富集。色譜 不同運行模式的色譜本身就是一種分析儀器，可以用來對欲測組分進行分析測試。不同運行模式的色譜又是一種分離技術，可將欲

10、測組分與干擾物質分離，然后用其他分析儀器進行脫機或聯(lián)機分析。在樣品處理中最常用的是柱色譜和薄層色譜。,膜分離技術在樣品處理中的應用,工作原理 利用不同高分子膜對不同化合物的滲透性有所不同，將欲測組分與樣品基體和干擾組分分離。在樣品處理中常用的膜分離技術有：滲析、超濾和電滲析。下表給出這三種膜分離的分離機理和應用。,,裝 置 目前樣品處理中常用的膜分離裝置有兩種類型：1. 平面膜：下圖給出平面膜與質譜或色譜

11、分析聯(lián)用結構圖,,2. 中空纖維膜：下圖給出中空纖維膜分離裝置結構圖,中空纖維膜,,,,,,吹掃氣體,樣品出口,,樣品入口,,,,捕集裝置或分析儀器,應 用 由于膜分離技術具有裝置結構簡單、操作程序方便、無需有機溶劑處理、可與各種分析儀器直接連接，易于實現(xiàn)自動化和在線操作等，所以膜分離技術的可應用于各類儀器分析的樣品處理。下面介紹一個應用實例：利用膜分離和氣相色譜聯(lián)用測定血漿中的乙醇。,吹掃氣體入口,,

12、,,,,,,,,,,,,,,,,吹掃氣體出口,氣相色譜,樣品瓶,,中空纖維膜,,血樣品和水,,膜-氣相色譜連接結構圖,,,0.3m -0.5m長的空心毛細管,,乙醇，6.4 mg/ml,血液樣品中乙醇的膜萃取-氣相色譜測定結果,測定血中乙醇三種方法的比較,,膜分離技術可以與各種捕集技術相結合，使欲測組分得到富集。,膜萃取-微捕集串聯(lián)與氣相色譜或質譜聯(lián)機結構圖,吹掃/捕集技術在樣品處理中的應用,工作原理 吹掃—捕集技術實質

13、上是一種連續(xù)氣體萃取技術（屬于動態(tài)頂空技術），吹掃氣（一般使用氮氣）通過液體或固體樣品，將樣品中的可揮發(fā)組分（其中包括欲測組分）帶出，然后用冷凍或固體吸附劑吸附的方法，將欲測組分捕集下來，再通過熱解吸的方法，將欲測組分解吸下來，進入分析儀器分析。,裝 置 目前已有多種商品化的吹掃—捕集裝置，各裝置在結構上雖有不同，但其流程和工作原理基本一致，下圖給出吹掃—捕集方法的流程圖：,吹掃和捕集方法流程圖示A 吹掃(萃取)；

14、B 解吸(進樣)；C 烘烤清洗1—溫除水系統(tǒng) 2—冷阱 3—冷除水系統(tǒng)4—熱阱 5—檢測器 6—除熱水器,吹掃氣,放空,烘烤氣,樣品排放,GC載氣,排氣,1,2,3,4,5,6,A,B,C,國外的吹掃—捕集裝置中捕集部分一般有低溫裝置（冷阱），解吸時的升溫速度也是很快的，瞬間即可達到解吸溫度，裝置的價格也是很高昂的。 國內太極公司研制的TJ-618樣品處理裝置也是一種吹掃—捕集裝置，它的解

15、吸升溫速度不是很快，但是它采用一種特殊技術來減少由于升溫過程而引起的進樣帶展寬，從而使裝置的成本大大降低，該裝置的價格僅為國外同類產品的1/3—1/2。下面給出幾種產品性能的對比。,性 能 指 標,應 用 吹掃—捕集技術主要用于氣相色譜和氣相色譜—質譜分析可揮發(fā)性化合物，特別是分析水中有機揮發(fā)性化合物。該技術已列入美國EPA方法中水中有機揮發(fā)性化合物分析的標準方法。 下面給出使用太極公司TJ-618樣品前處

16、理裝置，結合氣相色譜來鑒定真假紅塔山煙和對茶葉中農藥殘留所作的分析。,煙 草 數(shù) 據(jù)（固體樣品）,真紅塔山假紅塔山,,,,,,,茶葉農藥殘留檢測數(shù)據(jù)（固體樣品）,檢測器：電子捕獲檢測器,固相微萃取技術在樣品處理中的應用,工作原理 在一根很細的熔融石英纖維上，涂上吸附劑，用來吸附欲測組分，使其與干擾組分和基體分離，并得到富集。 被吸附劑吸附的欲測組分，可通過加熱或洗脫液洗脫的方法解吸下來，進入分析儀器

17、（主要是氣相色譜和液相色譜）。,裝 置 涂敷吸附劑的熔融石英纖維（稱為萃取頭）接在一根細的不銹鋼鋼絲上，外套一根細的不銹鋼管（在取樣和進樣時保護萃取頭），萃取頭在細的不銹鋼管中可自由伸縮進出。在取樣和色譜進樣時，由細的不銹鋼管穿透密封墊，然后再將萃取頭伸出。在拔出細的不銹鋼管前，將萃取頭縮進。下圖給出了固相微萃取裝置和色譜進樣的示意圖。,隔墊穿孔針頭,,,手柄,外套,活塞固定螺桿,Z-溝槽,連接器觀察窗口,可調節(jié)針頭

18、導軌/深度標記,纖維固定管,敷涂層的石英纖維,,彈簧,密封墊,固相微萃取裝置示意圖,固相微萃取的采樣和進樣操作方法,穿透樣品瓶密封墊暴露/提取撤回萃取頭插入GC注入口暴露/解吸撤回萃取頭插入進樣裝置到HPLC柱撤回萃取頭,應 用 主要應用于氣相色譜和液相色譜分析時的樣品處理，具有操作時間短，樣品量小，無需萃取溶劑，易實現(xiàn)自動化，適于分析揮發(fā)性與非揮發(fā)性物質，重現(xiàn)性好等優(yōu)點。很多研究結果表明，在樣品中加

19、入適當?shù)膬葮诉M行定量分析時，其重現(xiàn)性和精密度都非常好，是近年發(fā)展很快的一種樣品處理新技術。,根據(jù)欲測組分性質和樣品情況選用不同萃取方式,,熔融石英纖維,膜,樣品,涂層,樣品,涂層,(a) 直接萃取 (b) 頂空萃取 (c) 膜保護萃取,根據(jù)欲測組分的揮發(fā)性和極性選擇涂層 種類和涂層厚度,Poly(dimethylsiloxane),Poly(acrylate),PDMS/DVB,Carbowax/DVB,Ca

20、rbowax TR/DVB,吸煙婦女乳汁的固相微萃取—氣相色譜/質譜分析,1. 苯胺2.甲基苯胺3.二甲基苯胺4.三甲基苯胺5.尼古丁,時間（分）,毛細管固相微萃取器在水樣預處理中的應用,毛細管固相微萃取器是中科院大化所關亞風研究員等人研制開發(fā)的、用于水中半揮發(fā)和不揮發(fā)有機污染物分析的一種水樣預處理裝置。被分析樣品從管壁交聯(lián)固定相的中空毛細管通過，欲測組分被固定相吸附，然后再通過熱解析將欲測組分解析下來，進入GC或

21、GC－MS，進行分析。由于通過增加固定相的涂漬厚度和毛細管的長度和內徑，可以獲得比SPME固定相體積大十倍以上的固定相體積，使萃取富集倍數(shù)大大提高。,裝 置 流 程 圖,1.穩(wěn)壓閥 2.壓力表 3.水瓶 4.水罐 5.四通閥 6.廢水容器 7.六通閥 8.微型兩通接頭 9. 微型三通接頭 10.萃取毛細管柱 11.過濾器 12./13.穩(wěn)流閥 14.GC進樣器 15.毛細管預柱 16.毛細管分離柱

22、17.FID檢測器,應 用,微波技術在樣品處理中的應用,微波灰化 用微波高溫馬弗爐進行灰化，可不經炭化而一次完成灰化，所需灰化時間極短。與傳統(tǒng)馬弗爐相比，升溫速度極快，能在幾分鐘內迅速程序升溫至1000℃—1500℃，灰化時間也可減少數(shù)倍至數(shù)十倍。,微波消解 密閉式微波消解（微波高壓消解）：將放有樣品和消解液的消解罐放入微波爐內，用微波加熱，在高溫、高壓和微波的作用下，難消解的化合物很快消解，由于消解

23、罐是密閉的，故不會有任何元素損失。使用試劑少，消解速度快，所有時間比電熱板消解可減少數(shù)倍至數(shù)十倍，污染也大大減少。,微波萃取 在密閉的容器里，利用微波瞬間將萃取液加熱到常壓沸點以上，在微波的作用下，加快被萃取物從樣品中溶出。微波萃取所有的溶劑僅為常規(guī)萃取的數(shù)十分之一，而萃取速度為常規(guī)萃取的數(shù)十倍，萃取效率也要高。 下表給出了微波萃取（MAE）與超聲波萃取和索氏提取用于某些有機氯農藥殘留分析時結果的比較。,微波萃取

24、（MAE）與超聲波萃取和索氏提取法用于某些有機氯農藥殘留分析的比較,ASE快速溶劑萃取,工 作 原 理 ASE快速溶劑萃取是使用常規(guī)溶劑，利用提高萃取壓力和萃取溫度來提高萃取效率，縮短萃取時間，節(jié)省萃取溶劑。,工作原理圖,生物樣品的處理技術（方法）,生物樣品通常是指植物的花、葉、莖、根、種子等，動物(包括人)的體液(如：尿、血、唾液及生物體的分泌液)、毛發(fā)、肌肉和一些組織器官。欲分析的組分常有植物體內的微量元素、營養(yǎng)成

25、分、農藥殘留等等；動物體內的微量元素、藥物及代謝產物、糖類及有關化合物、脂類及長鏈脂肪酸化合物、維生素及輔酶類化合物、核苷、核苷酸及其衍生物、磷酸酯類化合物、固醇類化合物、胺、酰胺、氨基酸、多肽、蛋白及其衍生物和某些生物大分子（分子量在數(shù)千到數(shù)百萬的生物大分子）。由于生物樣品及某些欲測組分的特殊性，生物樣品的處理，除可使用上述的樣品處理常用技術外，在采樣、欲測組分的分離提取方面需采用一些特殊技術，現(xiàn)對這些特殊技術作些簡要介紹。,采

26、 樣 生物樣品一般采自動、植物活體，采樣方法與其他樣品有所不同，一般采用注射器吸取，手術刀、剪切割等方法采集。采樣時要注意采樣時機，因為生物活體總在新陳代謝；采樣后對采集的樣品要立即加以處理，因為生物樣品一般都有生物活性，如不立即加以處理，欲測組分就可能發(fā)生變化。如采集血樣后要立即加抗血凝劑；采集好某些器官組織后要立即加一些防腐劑，或立即進行速凍或脫水處理。生物樣品的采集最好在無菌條件下進行。,細胞的破碎 當生物樣

27、品中的欲測組分（主要是各種多肽激素、各種酶以及各種基因工程的產物如干擾素、胰島素、生長激素等等）存在于生物體細胞內及多細胞生物組織中時，需在分析測定它們之前將細胞和組織破碎，使這些欲測組分充分釋放到溶液中去。不同的生物體，或同一生物體的不同組織，其細胞破碎的難易程度不一樣，使用的方法也不完全相同。如動物胰臟、肝臟、腦組織一般比較柔軟，用普通的勻漿器研磨即可，肌肉及心臟組織較韌，需預先鉸碎再作成勻漿。植物肉組織可用一般研磨方法，含纖維較多

28、組織則必須在搗碎器內破碎或加砂研磨。許多微生物均具有堅韌的細胞壁，常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲波和加壓處理等方法?？傊?，破碎細胞的目的就是為了破壞細胞的外殼，使細胞內含物有效地釋放出來，獲得有效的提取。,常用細胞破碎方法,細胞的破碎方法,機械的,非機械的,液體剪切,固體剪切,脫水,溶胞作用,超聲波,機械攪拌壓力,研磨,壓力,空氣干燥,物理的,化學的,酶的溶菌,桿和臼,Hughes壓榨機,真空干燥,滲透沖擊,陽離子和陰離子洗滌劑,酶

29、和有關的酶噬菌體溶胞,球磨機,“X” 壓榨機,冷凍干燥,壓力釋放,溶劑干燥,凍結和融化,抗生素,抗菌素,甘氨酸,生物大分子的提取 生物大分子是指分子量在數(shù)千到數(shù)百萬的大分子。主要包括多肽、蛋白質、酶、核酸、多糖等生物大分子。它們在細胞破碎時被充分釋放出來。為了將它們制備成儀器分析的樣品就要用一定的溶劑將它們抽提出來，與細胞殘渣分離。這些生物大分子大部分可溶于水或含有少量酸、堿、鹽的水溶液。有時也加入一些有機溶劑改善欲測組分的提

30、取效率，并使欲測組分與其他組分分離。影響提取的因素較多，要根據(jù)經驗，結合具體實驗條件，特別是溶劑性質、pH值、離子強度、介電常數(shù)、提取溫度等主要因素靈活加以運用，選擇最佳條件和方法，達到提取的最佳效果。,蛋白的沉淀 在用儀器分析生物樣品中的一些小分子化合物及一些多肽類化合物時，蛋白質的存在，常常嚴重干擾分析，需要在制備儀器分析樣品時將這些蛋白質除去，常用的除蛋白質方法有以下一些： 1.加熱 當欲測組分熱

31、穩(wěn)定性好時，可采用加熱的方法將一些熱變性蛋白沉淀。加熱溫度視欲測組分的熱穩(wěn)定性而定，通?？杉訜岬?0℃。蛋白沉淀后可用離心或過濾除去，這種方法最簡單，但只能除去熱變性蛋白。,利用不同蛋白質在高濃度的鹽溶液中，溶解度不同程度的降低來沉淀除去蛋白質。在低鹽濃度下蛋白質溶解度隨著鹽濃度升高而增加，稱為鹽溶作用。當鹽濃度不斷升高時，不同蛋白質的溶解度不同程度下降，并先后析出沉淀，稱為鹽析作用。鹽析法的優(yōu)點是對設備和條件要求低，安全，應用范圍廣泛

32、，一般可在室溫下操作。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。硫酸銨的鹽析能力強，飽和液濃度大，溶解度受溫度影響小，一般不會使蛋白質變性。缺點是緩沖能力差，pH值常在4.5～5.5間。,2.鹽析,3.有機溶劑沉淀 蛋白質的沉淀與溶解，與溶劑的介電常數(shù)有關。降低溶液的介電常數(shù)，能增加蛋白質分子上不同電荷的引力，使其溶解度變小，同時還破壞蛋白質的水化膜而使蛋白質沉淀析出。乙醇和丙酮是最常用的有機溶劑，丙酮的介電常

33、數(shù)小于乙醇，故沉淀的能力較強 4.等電點沉淀 利用蛋白質在等電點時溶解度最低，用酸、堿調pH，可使蛋白沉淀析出，但這時沉淀不完全，可與有機溶劑沉淀法、鹽析法聯(lián)合使用。,5.膜分離 膜分離技術包括超濾、反滲透析、電滲析、微孔過濾、氣體滲析和超精密過濾等。利用膜分離技術可將欲測小分子化合物和大分子的蛋白質很好分離。 6.凝膠層析 利用分子大小不同的物質在流過凝膠固定相時的保留時間不同，大分子首先

34、流出，小分子最后流出，可將欲測小分子化合物與大分子蛋白質分離。這時欲測小分子化合物的濃度被流動相所稀釋，必要時還要進行濃縮。,7.柱層析 用能吸附蛋白質的材料裝填成小柱，使欲除蛋白質的樣品流過小柱，樣品中的蛋白質被柱填料吸附，欲測組份不被吸附，從小柱中流出。8.高速離心 高速離心是根據(jù)物質沉降系數(shù)、質量、浮力因子等不同，應用強大的離心力使物質分離、濃縮、提純的方法，是生物樣品制備中常用的分離方法之一。由于蛋

35、白質等生物大分子，分子量大，在高速離心時將首先沉淀在離心管底部，不同分子量的蛋白質等生物大分子沉降速度不同，也可按分子量大小沉降在離心管的不同位置，這樣就可以從離心管的不同位置取出樣品進行分析。,活體取樣－微透析技術 微透析是一種在不破壞（或破壞很少）生物體內環(huán)境的前提下，對生物體細胞液的內源性或外源性物質進行連續(xù)取樣和分析的新技術。將由膜制成的微透析探針植于需要取樣的部位，用與細胞間液非常接近的生理溶液以慢速度（0.

36、5～5µl/min）灌注探針，由于膜內外欲測組分的濃度差而使得膜外的體內欲測組分進入膜內，并被灌注液帶到體外，進入儀器。,微注射泵,,,,,,,,檢測系統(tǒng),,,,,,,,管子,,微透析探針,活體實驗動物,樣品處理技術的發(fā)展趨勢,自動化與分析儀器聯(lián)機新的分離技術不斷引入現(xiàn)有處理技術新組合樣品處理裝置體積和重量減小,樣品處理技術的發(fā)展趨勢就是要使處理樣品的過程要簡單、處理樣品的速度要快、處理樣品的裝置要小、處理樣品時所

37、需的化學試劑和樣品量要小、處理樣品時引進的誤差（欲測組分的丟失或沾污）要小、要提高欲測組分的選擇性和回收率。 Hawthorne等人對城市灰塵中測定PAH樣品用經典方法（索氏提?。?、脫機超臨界流體萃取與聯(lián)機超臨界流體萃取三種技術作了比較，結果（見下表）說明樣品處理技術的發(fā)展將大大縮短分析時間，大大減少樣品處理所需的化學試劑和樣品量。,科學技術的發(fā)展，一方面使分析儀器的性能不斷得到提高（最低檢出限、靈敏度、分辨率