半薄超薄切片技術(shù)

1、半薄/超薄切片技術(shù),,背景：,,,半薄切片,超薄切片,？,一、超薄切片技術(shù)介紹,固定地好滲透包埋地好切地好載網(wǎng)膜做地好染地好,超薄切片的基本要求:,超薄切片主要步驟,★取材★固定★漂洗、脫水★滲透、包埋★超薄切片★超薄切片染色,,每一步都是關(guān)鍵,任何環(huán)節(jié)的疏忽都會(huì)導(dǎo)致制片的失敗,1 取材,1.1 取材的基本要求   (1)動(dòng)作迅速，取材后快速放入固定液中；(2)體積要小，一般1㎜3，如果來不及，例如野外

2、取材，也可將組織修成（1×1×2）mm大小長(zhǎng)條形，之后再進(jìn)行分割。 (3)減小損傷，切割器械鋒利，操作輕，避免牽拉、挫傷與擠壓組織。(4)低溫操作，最好在低溫(0℃～4℃)下進(jìn)行，降低酶的活性。所用器具和固定液都應(yīng)預(yù)冷。 (5)取材部位要準(zhǔn)確。,1.2 取材方法 材料放在潔凈的韌性較大的紙上 滴上預(yù)冷的固定液 用刀片將組織切下并修小 用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有預(yù)冷的固定液的小瓶中。植

3、物材料的取材可以先切成薄片，經(jīng)適當(dāng)固定后再切成小方塊繼續(xù)固定。,,,,2 固定 (抽氣),2.1 固定的目的︾ 采用物理、化學(xué)等方法迅速殺死細(xì)胞的過程稱之為固定。︾ 目的是盡可能使細(xì)胞中的各種細(xì)胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，牢固地固定在它們?cè)瓉硭诘奈恢蒙希话l(fā)生位移。︾ 良好的固定是獲得精細(xì)結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)圖象的關(guān)鍵。,2.2 常用固定劑,(1)四氧化鋨 (OsO4)-- OSMIUM TETRAOXIDE ※強(qiáng)

4、氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，可較好的固定脂肪、蛋白質(zhì)、磷酸脂蛋白；※固定變性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原；※具有固定和電子染色雙重作用，樣品圖象反差較好；▼酶的鈍化劑，不適合細(xì)胞化學(xué)的固定；▼與乙醇/醛類反應(yīng)生產(chǎn)沉淀－－漂洗●分子較大,滲透速度緩慢,但反應(yīng)迅速,均勻固定深度0.25㎜；●固定時(shí)間一般為1-2小時(shí),時(shí)間太長(zhǎng)易使組織變脆,切片困難；●鋨酸固定液常用濃度：1％－2％;

5、 極易揮發(fā)，對(duì)粘膜、角膜毒性極大,操作要十分小心!,(2)戊二醛 (  C5H8O2)--glutaraldehyde ※有效保存組織細(xì)微結(jié)構(gòu),對(duì)蛋白質(zhì)的固定效果好；※滲透力強(qiáng),滲透速度快,較好的固定糖原、核蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)、有絲分裂的紡錘絲及胞飲小泡等；※保存某些酶的活力,較好保存抗原,適于細(xì)胞化學(xué)研究；※對(duì)組織和細(xì)胞的穿透力比四氧化鋨強(qiáng)，均勻固定深度

6、:0.5~1mm ,0－4℃可長(zhǎng)時(shí)間固定(幾周甚至1～2個(gè)月)不會(huì)使組織變脆，可用于遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的取材;▼缺點(diǎn):不能保存脂肪，磷脂固定效果差，對(duì)細(xì)胞膜的顯示較差，沒有電子染色作用。,(3)甲醛-Formaldehyde ※滲透組織的能力比戊二醛強(qiáng)，對(duì)于致密組織（種子）固定作用好；※細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)保存質(zhì)量不如戊二醛，但酶活性的保存優(yōu)于戊二醛；▼缺點(diǎn)：不能較好的固定細(xì)胞基質(zhì)，脫水后大部分細(xì)胞基質(zhì)將丟失；＊常用多聚甲醛－戊二醛的混合固

7、定液。,(4)高錳酸鉀※強(qiáng)氧化劑，較好固定脂蛋白;※對(duì)神經(jīng)髓鞘、葉綠體及其他各種膜結(jié)構(gòu)的研究均可作為固定劑；※只用于某些常用固定劑難以固定的植物和酵母樣品，且一般不需要用鋨酸后固定.,3漂洗、脫水,3.1漂洗漂洗的目的:☆組織固定后脫水前的漂洗: 清除殘留固定劑,減小固定劑和脫水劑之間的反應(yīng)，避免沉淀物干擾超微結(jié)構(gòu)的觀察.☆雙重固定中,在鋨酸固定前的漂洗: 避免鋨酸與戊二醛反應(yīng)生成細(xì)小而致密的餓沉淀，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

8、.,3.2 脫水目的 將組織內(nèi)的游離水徹底清除,保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部。方法 用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來取代水,常用的脫水劑是乙醇和丙酮。,注意事項(xiàng)脫水梯度逐級(jí)進(jìn)行, 急劇脫水會(huì)引起細(xì)胞收縮。（ 30% →50%→70%→80%→95%→100%→100%）;更換溶液動(dòng)作要快。長(zhǎng)時(shí)間暴露空氣中會(huì)在組織內(nèi)外產(chǎn)生微小氣泡，影響滲透；脫水過程中應(yīng)在70%脫水劑中4℃停留或過夜,過度脫水不僅引起更多物質(zhì)

9、的抽提，而且會(huì)使樣品發(fā)脆，造成切片困難;置換用脫水劑：環(huán)氧丙烷（Epon812）、二甲苯（石蠟）。,4 滲透和包埋、聚合,4.1滲透滲透就是利用包埋劑滲入到組織內(nèi)部取代脫水劑的過程。 包埋劑在單體狀態(tài)時(shí)(聚合前)為液體，能夠滲入組織內(nèi)，當(dāng)加入某些催化劑，經(jīng)加溫或其他條件，能聚合成固體，以便進(jìn)行超薄切片。,4.2 包埋、聚合,包埋操作： 將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中或膠囊中，一定條件下可聚合硬化，形成包埋塊。,包埋板,

10、1,包埋管膠囊,常用的包埋劑,◆環(huán)氧樹脂(epoxy  resin),◆水溶性樹脂－丙烯酸類樹脂 LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等，適于進(jìn)行組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)研究的樣品制備。 適于低溫包埋，通常用于免疫電鏡樣品的制備。,包埋操作中的注意事項(xiàng)§所有試劑要防潮，最好存放在干燥器中；§所用器皿應(yīng)烘干；§配包埋劑時(shí)，每加入一種試劑要攪拌均勻；§包

11、埋時(shí)動(dòng)作要輕巧，防止產(chǎn)生氣泡；§盛放過包埋劑的容器要及時(shí)用丙酮清洗干凈.§皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；,5 超薄切片,5.1修塊削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑，修成金字塔形，頂面修成梯形或長(zhǎng)方形，每邊的長(zhǎng)度為0.2mm～0.3mm。,5.2 超薄切片    超薄切片機(jī)：LEICA ULTRACUT R超薄切片厚度:

12、 <100nm,一般 50-70nm,5.3 載網(wǎng)和支持膜,載網(wǎng)(超薄),直徑：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm,,5.3 載網(wǎng)和支持膜,(2) 載網(wǎng)支持膜膜的要求:透明無結(jié)構(gòu),并能承受電子束的轟擊.支持膜的種類: 火棉膠膜 聚乙烯醇縮甲醛膜(formvar膜) 碳膜,,膜的厚度:10nm～20nm,6 超薄切片的染色,目的:

13、 增強(qiáng)樣品的反差,提高圖象的清晰度.常用染色劑: 重金屬鹽 各種染料,常用的染色劑: 醋酸鈾和檸檬酸鉛。染色方法：(1) 組織塊染色 在脫水至70%乙醇時(shí)，將組織塊放在用70%乙醇配制的飽和醋酸鈾溶液中，染色時(shí)間2小時(shí)以上，或在冰箱中過夜。,▲超薄切片染色,(2)超薄切片后染色,醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染,鈾染:細(xì)胞核及結(jié)締組織染色鉛染:提高細(xì)胞質(zhì)成分的反差

14、,1）前固定（固定液體積是固定材料的十倍以上，材料不堆積）3%戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2，室溫5-6h，后4°C保存2）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次3）后固定1%鋨酸固定 in 0.1M PBS，4°C overnight4）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次5）系列脫水：30%-50%-70%（4

15、°C, overnight,可以停下）-80%-95%-100%-100%）用丙酮置換乙醇：乙醇:丙酮=1:1，純丙酮2次， 每級(jí)20-30分鐘6）滲透丙酮:樹脂=2:1， 1:1（可以停下了，overnight） ，1:2 2-3h/級(jí)純樹脂12h，換純樹脂12h （從進(jìn)入樹脂開始更要嚴(yán)格防潮！）7）包埋聚合 60°C 24hr注意：免疫電鏡時(shí)不用鋨酸固定，樹脂換成LRWhit

16、e等水溶性樹脂，固定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2,超薄切片圖片,二、半薄切片技術(shù)介紹,半薄切片主要步驟,★取材★固定★漂洗、脫水★滲透、包埋★半薄切片★半薄切片染色,,每一步都是關(guān)鍵,任何環(huán)節(jié)的疏忽都會(huì)導(dǎo)致制片的失敗,FAA固定液（福爾馬林5-冰醋酸5-70%酒精90）半薄/石蠟切片※一般固定根、莖、葉、花藥、子房組織切片?！啄鄄牧嫌?0%酒精代替70%酒精，防止材

17、料收縮；※加入5%甘油可防固定液蒸發(fā)和材料變硬。,卡諾固定液,,滲透迅速，固定根尖和花藥只需30-60分鐘，但固定時(shí)間不能太久，一般不超過一天,切片厚度：0.5~5um切片撈到載玻片上,半薄切片,▲半薄切片染色,染料介紹,染色原則：先用堿性染料染再用酸性染料染,,半薄切片：免疫熒光 （LRWhite包埋）,半薄切片圖片,三、刀具介紹,玻璃刀,,,鉆石刀,超薄切片機(jī),型號(hào)：LEICA ULTRACUT