實驗動物微生物學分類及控制

1、實驗動物微生物學分類及控制,第一節(jié) 實驗動物微生物學控制,,實驗動物如受到病原微生物、寄生蟲的污染，其正常狀態(tài)的平衡將遭致破壞，引起動物發(fā)病，從而給動物的生產及實驗的正常進行帶來嚴重影響。有的不立即發(fā)病，但處于可能發(fā)病的污染狀態(tài)，即機會致病因子的潛在性感染時，如再施加做為附加因素的實驗處理，動物可能發(fā)病。,一.實驗動物微生物質量控制的原因,病原體在動物體內增殖和導致動物發(fā)病，致使降低動物的生產效率及動物質量，使動物生產設施蒙受重大經濟

2、損失，影響實驗的進行。此外還存在許多人獸共患的傳染病，從事動物生產、實驗的飼養(yǎng)者，實驗人員也有發(fā)病的危險。,1．引起實驗動物的疾病和死亡 不同的實驗動物遺傳背景不同,對某種疾病的易感性也不同.某些烈性傳染病如鼠痘、兔出血癥、犬細小病毒性腸炎等的流行，可導致動物大批死亡或質量下降，從而給動物的生產和實驗的正常進行帶來嚴重影響。,2.干擾實驗結果 實驗動物的微生物和寄生蟲感染可不同程度干擾實驗結果，從而影響研究工作的準確性和可靠性，甚至

3、得出錯誤的結論。隱性感染常導致動物生理生化指標的改變，使實驗得不到應有的結果?；蛞驅嶒炋幹?，動物抵抗力下降，使隱性感染顯性化，導致疾病的發(fā)生。,,,掠奪宿主的營養(yǎng);體外寄生蟲對動物的騷擾;對宿主機體產生機械性損傷;對宿主產生毒性作用;對宿主生理、生化和免疫系統(tǒng)的影響。,實驗動物感染寄生蟲后，不僅蟲體對機體造成一定的損害，動物機體也對蟲產生反應，使動物機體的生理、生化及免疫學指標發(fā)生改變，從而影響實驗結果。,3.人獸共患病 許多

4、實驗動物傳染病為人獸共患性疾病，這些傳染病可在人與動物之間傳播流行，因而也對飼養(yǎng)和研究人員的健康構成威脅。特別是那些在動物呈隱性感染、而對人類呈致死性感染的病原微生物（如流行性出血熱病毒），應引起我們高度重視。,4．影響生物制品的質量 使用在人身上的血清、疫苗和別的生物制品必須是安全的、無污染的。如病原微生物污染了細胞培養(yǎng)物、腫瘤移植物或以動物組織和細胞為生產原料的生物制品，不僅干擾實驗，而且還可將病原擴散，以至危害人類的健康。如果實

5、驗動物是用于生產生物制品的目的，其來源必須擺脫大量的能引發(fā)人類潛在人獸共患病的、帶有特別病原體的動物群體。,,隨著現代科學的發(fā)展和西方動物保護主義運動的影響，實驗動物科學已從過去注重于動物的飼養(yǎng)管理和實驗操作，愈來愈集中于動物的福利和實驗結果的質量。實驗動物使用總量下降，高質量實驗動物使用量增加。,早在七十年代，發(fā)達國家的實驗動物在使用量上已經趨于平衡。但是，高質量實驗動物的使用數量呈上升趨勢，普通級、清潔級動物逐漸被SPF級取代。目前

6、發(fā)達國家使用的大、小鼠等小型實驗動物大多為SPF級. 2019年在全國基本普及使用清潔級實驗大鼠、小鼠。某些重點科研項目用實驗動物，達到SPF級水平。,1.感染源 (1)內源性 (2)外源性 2.傳播途徑: 實驗動物;生物材料;工作人員;材料和設備 3.易感動物,二、實驗動物微生物和寄生蟲感染的基本要素,重要的人獸共患病主要的烈性傳染病常見的微生物和寄生蟲感染,三、實驗動物常見感染性疾病,流行性出血熱弓

7、形蟲病淋巴細胞脈絡從腦膜炎沙門菌病狂犬病猴B病毒感染猴結核病,1.重要的人獸共患病,鼠痘兔出血癥（兔瘟）,2.主要的烈性傳染病,鼠肝炎病毒感染仙臺病毒感染鼠肺支原體病嗜肺巴斯德桿菌病小鼠呼腸孤3型病毒感染球蟲病犬細小病毒感染犬瘟熱,3.常見的微生物和寄生蟲感染,不同等級嚙齒類、兔、犬和猴等實驗動物要求排除的細菌、病毒、寄生蟲應根據國家技術監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布的有關實驗動物微生物學等級及監(jiān)測標準(GB14922

8、.2—2019、GB14922.1—2019)。,四、實驗動物的微生物和寄生蟲控制國家標準,第二節(jié) 實驗動物的微生物等級,GB 14922-1994《實驗動物 微生物學和寄生蟲學監(jiān)測等級（嚙齒類和兔類）》 將我國實驗動物分為四級，即一級動物（普通級）、二級動物（清潔動物）、三級動物（無特殊病原體動物）和四級動物（無菌動物）。 GB 14922.2-2019《實驗動物 微生物學等級及監(jiān)測》(2019年5月1日開始實施)新標準對

9、實驗動物等級進行了重新設定，將實驗小鼠和大鼠的微生物學等級分為清潔級、無特定病原體級（SPF）和無菌級，取消了普通級。豚鼠、地鼠和兔仍保留四級。犬和猴分為普通級和SPF級。,一、普通級動物,定義普通級動物（Conventional Animal CV）是在微生物學控制上要求最低的動物，它要求不攜帶人獸共患病和動物烈性傳染病的病原。如鼠痘病毒、流行性出血熱病毒、弓形體等，飼養(yǎng)于普通環(huán)境中。應用：舉例說明,應用,用于醫(yī)學生物學中的

10、教學示范和科學實驗的預實驗。,二、清潔級動物,定義 清潔級動物（ Clean animal ， CL ）是指除普通動物應排除的病原體外，不攜帶對動物健康危害大和對科學研究干擾較大的病原的動物，如鼠肝炎病毒、仙臺病毒、體外寄生蟲等，飼養(yǎng)于半屏障環(huán)境。應用：舉例說明,應用,國際上普遍認為CL動物僅適合于短期或部分科研試驗。根據國外實驗動物工作發(fā)展及國內的具體條件，CL動物近年來在我國得到了廣泛的應用。它較普通動物健康，又較SPF易達

11、到質量標準，在動物實驗研究中可免受動物疾病的干擾，其敏感性及重復性亦較好。因此，我國針對自己的實際情況認為這類動物目前可適用于大多數科研實驗，應是國內科研工作主要要求的標準級別的動物，可應用于生物醫(yī)學研究的各個領域。,三、無特定病原體動物,定義 無特定病原體動物（ Specific Pathogen free,SPF ）是指除清潔級動物應排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學實驗干擾大的病原的動物，又稱SPF動物。飼養(yǎng)于

12、屏障環(huán)境。應用：舉例說明,應用,選擇SPF動物，避免了病原體的隱性感染或潛伏感染及某些條件性致病菌對實驗結果的影響，因此國際上公認SPF動物適用于所有科研試驗，是目前國際標準級別的實驗動物，疫苗生產必須應用SPF動物。利用SPF雞生產疫苗、抗體：麻疹流行性腮腺炎二聯活疫苗、抗輪狀病毒卵黃免疫球蛋白、抗大腸桿菌O157∶H7雞卵黃抗體等。,藥物安全評價：實驗能否持續(xù)取決于污染的可能性老年病學研究：SPF動物的壽命普遍超過普通動物免

13、疫學研究： 免疫缺陷動物只有SPF級或以上級別 動物才能保種、繁殖.,四、無菌動物,定義 無菌動物（ Germ-Free Animal,GF）是指無可檢出的一切生命體的動物。飼養(yǎng)于隔離環(huán)境。應用：舉例說明,無菌動物的發(fā)展過程,1895—1910年 解決了無菌生命能否生存的問題。Pasteur認為動物沒有腸道菌參與不能生存。生物學家NenK提出了相反的看法，由此開展了一場學術上的爭論。十年后，1895年

14、Nuttall 和Thierfelder經剖腹產，用牛奶飼喂獲得了無菌豚鼠，第八天后處死，腸道內未檢出細菌。1898年Scottellies獲得了無菌雞，無菌環(huán)境中養(yǎng)活了17天，至此建立了無菌生命可以存活的論點。,無菌動物的特點,（一）形態(tài)學改變消化系統(tǒng)：無菌動物盲腸及其內容物重量可達體重25%，多數情況下，無菌動物盲腸是普通動物的5—10倍。無菌動物由于盲腸膨大，腸壁菲薄，常易發(fā)生腸扭轉導致腸壁破裂而死亡。有關盲腸膨大原因尚無定論。

15、血液循環(huán)系統(tǒng)：心臟相對變小，白細胞數少，且數量波動范圍小，與無病原體入侵有關。免疫系統(tǒng)：由于無菌動物幾乎沒有受過抗原刺激，其免疫機能基本上處于原始狀態(tài)。胸腺中網狀上皮細胞較大，其胞漿內泡狀結構和溶酶體較少，胸腺和淋巴結處于不活躍狀態(tài)，脾臟變小。,（二）生理學改變,免疫功能：由于網狀內皮系統(tǒng)、淋巴組織發(fā)育不良，淋巴小結內缺乏生發(fā)中心，產生γ-球蛋白的能力很弱。血清中IgM、IgG水平低，免疫功能處于原始狀態(tài)，應答速度慢，過敏反應、對異

16、體移植的排斥反應以及自身免疫現象消失或減弱。用低分子無抗原飼料飼喂無菌動物時，血清中幾乎不存在γ-球蛋白和特異性抗體。生長率：無菌禽類>普通禽類 ；無菌大小鼠≈普通大小鼠 無菌豚鼠、家兔<普通豚鼠、家兔,繁殖率：規(guī)律同生長率代謝：血中含氮量少，腸管對水的吸收率低，代謝周期比普通動物長。營養(yǎng)：無菌動物體內不能合成VB和VK，易發(fā)生缺乏癥?？馆椛淠芰Γ簾o菌動物能力強于普通動物，無菌小鼠抗實驗性燙傷引

17、起的休克死亡能力也強于普通小鼠。壽命：無菌動物>普通動物,無菌動物的應用,在微生物學研究中的應用在免疫學研究中的應用在放射醫(yī)學研究中的應用在營養(yǎng)、代謝研究中的應用在老年病學研究中的應用,在心血管疾病研究中的應用在毒理學研究中的應用在腫瘤學研究中的應用在宇航醫(yī)學研究中的應用在寄生蟲學研究中的應用在口腔醫(yī)學研究中的應用,抗體制備研究 普通動物體內細菌種類多，很難制備較純的抗體;無菌動物缺乏抗原刺激，免疫系統(tǒng)

18、處于“休眠”狀態(tài),對外來刺激，有迅速、單一和持久作出反應的特性，如果接種單一的菌株，會產生較純的、高效價的、且不會污染其他微生物的抗體。,五、悉生動物,悉生動物也稱已知菌動物或已知菌叢動物，是指在無菌動物體內植入已知微生物的動物。屬四級動物，飼養(yǎng)于隔離系統(tǒng)。分為單菌、雙菌和多菌動物。,悉生動物的特性,悉生動物腸道內存在能合成某種維生素和氨基酸的細菌，不象GF動物發(fā)生維生素缺乏癥，生活力較強，抵抗力明顯增加，易于飼養(yǎng)管理。中國藥檢所利用

19、五聯菌悉生動物（大腸埃希氏桿菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌、糞鏈球菌和乳酸桿菌）可替代無菌動物進行藥物檢定。,悉生動物在生物醫(yī)學研究中的應用,,微生物學研究在無菌動物斷奶前后，接種一種或多種菌，可觀察這些細菌對機體的作用。了解細菌之間及細菌與機體之間相互關系和菌群失調現象。觀察機體、微生物、致病因子三方面相互作用的關系。,第三節(jié) 潔凈動物與普通動物的 特性比較,潔凈動物是指來源于剖腹產，實行嚴格的微生物控制，飼養(yǎng)

20、于空氣凈化設施內的動物，主要包括：清潔動物、SPF動物、悉生動物和無菌動物。,一、各等級動物的相關關系,二、微生物控制比較,由于動物分類等級不同，因而其微生物控制程度也不一致，與之相對應的動物飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)管理方法也各不相同。,按微生物控制程度的實驗動物分類原則,,,,三、對科研實驗結果影響的比較,四等級動物優(yōu)缺點比較,四、如何選擇不同等級的實驗動物？,,GF、 GN動物在絕對屏障內維持，管理復雜，無菌狀態(tài)的保持難、產量低、價格高，實際

21、應用有限。 GN動物多用于研究微生物與微生物、微生物與宿主間相互關系的動物模型。SPF動物在相對屏障中維持，易管理、產量大、價格低。因其不攜帶病原體，不影響實驗結果，在發(fā)達國家己廣泛應用，是目前國際標準級別的實驗動物。,五.等級動物優(yōu)缺點比較,CL動物近年來在我國得到了廣泛的應用。它較普通動物健康，又較SPF易達到質量標準，在動物實驗研究中可免受動物疾病的干擾，其敏感性及重復性亦較好，是國內科研工作主要要求的標準級別的動物，可應用于生物

22、醫(yī)學研究的各個領域。,選擇標準,對于實驗動物的微生物學級別選擇，應根據其各級動物的特點、應用范圍及課題的水平高低，選用相匹配的微生物學級別的實驗動物。一般而言，教學示范選用普通動物，清潔動物是國內科研工作要求的標準動物，適合于大多數科研課題，而SPF動物則是國際標準的實驗動物，對于一些具有國際交流意義的重大課題，最好選用SPF動物，但無菌及悉生動物為非常規(guī)動物，僅在特殊課題需要時才選用。,,注：“+”可能或必須用；“-”不可能或適用；“

23、*”不用或不能用,不同等級動物在生命科學的應用,（一）監(jiān)測意義 實施微生物學與寄生蟲學監(jiān)測，是保證實驗動物質量及標準化的必要手段。通過監(jiān)測可掌握動物群中病毒、細菌、寄生蟲的流行情況，及時診斷感染性疾病，發(fā)現并控制其傳播，以保證實驗動物的健康。,第四節(jié)、實驗動物微生物學和寄生蟲學質量監(jiān)測,（二）監(jiān)測內容 不同級別實驗動物的微生物和寄生蟲監(jiān)測內容不同，見國家標準GBl4922.1—2019和GBl4922.2—2019

24、 。（三）檢驗方法 目前使用國標推薦的方法和詳細檢驗程序。病原菌以分離培養(yǎng)鑒定為主，病毒以檢測抗體為主，寄生蟲以鏡檢為主。,病毒常用檢測方法有血清學和病原學檢測細菌學常用的檢測方法是進行病原菌的分離培養(yǎng)真菌監(jiān)測主要采用分離培養(yǎng)法（沙式培養(yǎng)基）寄生蟲監(jiān)測采用肉眼觀和鏡下觀察,（四）檢驗程序 抽取動物↓編號↓體外檢查↓麻醉↓取血——血清檢查病毒抗體或其他病原的抗體↓體外寄生蟲檢查——皮膚

25、取樣——真菌檢查↓ 臟器、腸內容物、——無菌解剖——氣管分泌物、腸內容物、糞便，體內寄生蟲檢查 ↓ 臟器分離細菌檢測↓檢測報告,規(guī)定了實驗動物質量判定原則，即：經檢測，如有一項指標不符合該級別標準要求，則判為不符合該級別標準。根據檢驗結果，由檢驗人員及其負責人簽發(fā)檢測報告。,（五）報告,第五節(jié) 實驗動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施,實驗動物（除大型或稀有實驗動物），不應采取疫苗接種或藥物治療

26、第一，應用疫苗或治療制劑可能干擾實驗結果，而使實驗無效。如使用抗生素或磺胺類藥物可使動物的肝、膽、腎等臟器組織產生毒性損傷，影響實驗結果；,第二，經過治療或免疫的動物，外表健康，但仍帶菌或帶毒，成為潛在的傳染源。如沙門氏菌即使采取藥物治療，也不能使其從動物群中徹底根除。又如小鼠肝炎病毒，雖用疫苗免疫可以產生免疫力，但有些小鼠仍可帶毒，使其在小鼠群中長期存在；第三，對小型實驗動物，采取治療措施，尤其是需用特殊藥物的個體治療，經濟上也不合

27、算。,一、實驗動物的防疫原則,隔離飼養(yǎng)：各種動物要分開飼養(yǎng)，嚴禁混養(yǎng)在一起。防止交叉感染。引進動物要嚴格檢疫：依據國家檢測標準進行，要從具有動物質量合格證的單位引進動物。堅持衛(wèi)生消毒制度：杜絕各種微生物的侵入和繁殖。其中定期對動物房舍和飼養(yǎng)用具的消毒是必不可少的。,飼養(yǎng)管理人員要定期健康檢查，有人畜共患病者，應調離與動物接觸的工作崗位。保種單位要對保種的動物定期進行質量檢查，發(fā)現問題及時更新種群。對國標要求必須實施預防接種的實驗

28、動物要定期進行免疫接種。嚴格防止野生動物侵入實驗動物室，對死亡動物進行無害化處理。,二、平時的預防措施,①飼養(yǎng)人員應嚴格按照不同等級實驗動物的飼養(yǎng)管 理和衛(wèi)生防疫制度和操作規(guī)程，認真做好各項記 錄，發(fā)現情況，及時報告。 ②實驗動物設施周圍應無傳染源，不得飼養(yǎng)非實驗 用家畜家禽，防止昆蟲及野生動物侵入。 ③堅持平時衛(wèi)生消毒制度，降低環(huán)境設施中的病原 體含量。 ④不從疫區(qū)引進實驗動物。,⑤各類

29、動物應分室飼養(yǎng)，以防交叉感染。飼養(yǎng)室 嚴禁非飼養(yǎng)人員出入和各類人員互串，購買或領 用動物者不得進入飼養(yǎng)室內。 ⑥飼料和墊料庫房應保持干燥、通風、無蟲、無 鼠、飼料應達到相應的國家標準。 ⑦飼養(yǎng)人員和獸醫(yī)技術人員應每年進行健康檢查， 患有傳染性疾病的人員不應從事實驗動物工作。,三、發(fā)生疫病時的撲滅措施,①及時發(fā)現、診斷和上報疫情，并通知鄰近單位做 好預防工作。 ②迅速隔離患病動

30、物，污染的環(huán)境和器具緊急消毒。 ③若發(fā)生危害性大的疫病，如鼠痘、流行性出血熱 等應采取封鎖等綜合性措施。疫情撲滅經消毒處 理后一個月方可解除封鎖。 ④病死和淘汰動物應采取焚燒等措施合理處理。 ⑤應及時報上級管理部門和防疫部門。,四、消毒措施,隨時消毒：在發(fā)生傳染病時，為了及時消滅剛從患病動物體內排出的病原體而采取的消毒措施。消毒的對象包括患病動物所在的房舍、隔離場所以及被患病動物分泌物、

31、排泄物污染和可能污染的一切場所、籠具等。通常在解除封鎖前，進行定期的多次消毒，患病動物隔離舍應每天和隨時進行消毒。,預防性消毒：結合平時的飼養(yǎng)管理定期對實驗動物房、籠架具、飲水等進行定期消毒，以達到預防一般傳染病的目的。終末消毒：在患病動物解除隔離、痊愈或死亡后，或者在疫區(qū)解除封鎖之前，為了消滅疫區(qū)內可能殘留的病原體所進行的全面徹底的大消毒。,五、隔離措施,隔離患病動物和可疑感染的動物是防制傳染病的重要措施之一。隔離是為了控制傳染源，

32、防止健康動物繼續(xù)受到傳染，以便將疫情控制在最小范圍內就地予以撲滅。隔離時應選擇不易散播病原體、消毒處理方便的地方或房舍進行。如患病動物數目較多，可集中隔離在原來的動物房內。,隔離場所禁止閑雜人員和動物出入和接近。工作人中員出入應遵守消毒制度。隔離區(qū)內的用具、飼料、糞便等，未經徹底消毒處理，不得運出。對于發(fā)生烈性人獸共患病（如流行性出血熱等）的動物群，應及時采取有效措施，全群撲殺，嚴格消毒，防止疫情進一步擴散。,第六節(jié) 潔凈動物的培育及

33、 飼養(yǎng)管理,(一)無菌動物的培育,主要采用生物凈化法即剖腹產技術。對于小動物，多用子宮摘除術；大動物，多采用子宮切開術。器械消毒剖腹產母鼠及帶乳母鼠的準備子宮摘除術胎仔處理剖腹產仔鼠的哺育無菌檢測,,在無菌隔離器中進行,一、無菌動物的培育及飼養(yǎng)管理,,,剖腹產母鼠與帶乳鼠的準備 選擇合適的母鼠作為剖腹產母鼠，按實驗要求，10～12周齡鼠，雌雄鼠以1：1合籠，每日早晚兩次觀察有無陰道栓，或用陰道拭子涂片染色，

34、檢查其中有無精子。以出現陰道栓或發(fā)現精子作為妊娠半天計算。剖腹產手術應在妊娠19.5天為好。 另選擇無菌母鼠作為代乳鼠。剖腹產母鼠與帶乳鼠應同步交配. 帶乳鼠較剖腹產鼠提前2-3天交配。,,剖腹產仔鼠的哺育,（1）人工哺乳（2）代乳方法 由無菌子宮摘除術獲得胎仔，由哺乳中的無菌小鼠給予代乳。乳姆鼠的選擇一般要考慮其綜合性能，選擇母性強的個體作為乳姆鼠。,,①將代乳母鼠仔鼠留下2—3只，其他棄掉，優(yōu)秀的可棄去全部親生仔鼠。

35、②將代乳母鼠籠內的墊料充分分散到被代乳仔鼠身上，悄悄地置于代乳鼠腋下。③一但確認被代乳鼠吸吮代乳鼠的乳汁，就將代乳鼠自產仔鼠棄掉。④代乳4周齡即可離乳。,無菌檢測,對乳姆鼠、剖腹產仔鼠的無菌檢測，應在手術后的7、12、25天進行，對了解動物體內的微生物狀況，保證動物的質量極為重要。,（二）悉生動物的培育,傳入 授入已知微生物材料 無菌隔離器 無菌動物,,,二、SPF動物、清潔