實驗五-枯草桿菌蛋白酶活力測定

1、實驗五枯草桿菌蛋白酶酶活力測定一、實驗目的實驗目的1.加深了解酶活力的概念。2.學習掌握測定蛋白酶活力的方法。二、二、實驗原理實驗原理酶活力指酶催化某一特定反應的能力。其大小可用在一定條件下酶催化反應進行一定時間后，反應體系中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來表示。酶活力單位是表示酶活力大小的重要指標。本實驗規(guī)定酶活力單位(U)為一定條件下每分鐘分解1μg酪氨酸所需的酶量。實驗選用枯草桿菌蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸的反應體系。產(chǎn)物酪氨酸在堿性

2、條件下與Folin酚試劑反應生成藍色化合物，該藍色化合物在680nm處有最大光吸收，其吸光值與酪氨酸含量呈正比。因此通過測定一定條件下產(chǎn)物酪氨酸的含量變化，可計算出蛋白酶的活力。三、三、儀器儀器和試劑和試劑儀器儀器:恒溫水浴鍋、分光光度計、試管及試管架、干燥濾紙、玻璃漏斗。原料：原料：枯草桿菌蛋白酶：稱取1g枯草桿菌蛋白酶粉，用少量0.02molL，pH7.5磷酸緩沖液溶解并定容至100mL，震蕩15分鐘，使充分溶解，干紗布過濾，取濾液

3、冰箱備用。使用時視酶活力高低用緩沖液適當稀釋。試劑試劑：1.Folin酚試劑：（可以直接購買）在2L磨口回流瓶中加入鎢酸鈉(Na2WoO4.2H2O)100g，鉬酸鈉(Na2WoO4.2H2O)25g，蒸餾水700mL，85%磷酸50mL以及濃鹽酸100mL，充分混勻后，微火回流加熱10小時。再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50mL和液溴數(shù)滴，搖勻后開口繼續(xù)煮沸15min，以驅(qū)趕過剩的溴。冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，過濾，收集濾液(對

4、照液)。以上兩過程，應各做一次平行實驗。2.濾液中酪氨酸含量的測定取3支試管，分別加入1.0mL水、A液、B液，然后各加入5.0mL0.55molL碳酸鈉溶液和1.00mLFolin酚試劑，搖勻按標準曲線制作方法保溫并測吸光度值。根據(jù)吸光度值，由標準曲線查出A、B液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力單位。五、計算A樣品—樣品液的吸光度值A對照—對照液的吸光度值K—標準曲線上A=1時對應的酪氨酸μg數(shù)V—酶促反應液的體積(本實驗為5mL