枯草桿菌α-淀粉酶基因克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、α-淀粉酶是一種重要的工業(yè)用酶，一般采取篩選高產(chǎn)α-淀粉酶菌株或利用基因工程技術(shù)構(gòu)建α-淀粉酶分泌型工程菌規(guī)模生產(chǎn)，以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。本文利用低溫顯色法和搖瓶發(fā)酵法，從樣品中篩選出一株產(chǎn)α-淀粉酶菌株XL-15，初測酶活力達(dá)到30.0U/mL。通過菌落形態(tài)、菌體特征觀察以及16S rDNA序列比對鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis XL-15)。發(fā)酵粗酶液經(jīng)硫酸銨初步沉淀、透析脫鹽后，對其基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步分

2、析。結(jié)果表明所產(chǎn)α-淀粉酶最適反應(yīng)pH和溫度分別為6.5和50℃，Ca2+、Mn2+對該酶有激活作用，而Cu2+、Zn2+和EDTA對其有抑制作用，酶動力學(xué)實驗測得的米氏常數(shù)Km值為1.726mg/mL。
　　 本研究以B. Subtilis XL-15基因組DNA為模板，運(yùn)用PCR方法成功克隆了α-淀粉酶基因。該擴(kuò)增片斷中含α-淀粉酶基因自身信號肽序列，開放式閱讀框(ORF)大小為1980bp，編碼659個氨基酸殘基。將該結(jié)構(gòu)

3、基因分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28-Amy和pPIC9K-Amy，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)和畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)表達(dá)。結(jié)果表明：大腸桿菌菌體破碎上清液中未檢測出酶活性，SDS-PAGE電泳分析顯示表達(dá)產(chǎn)物均以無活性的包涵體形式存在；而畢赤酵母在α-Factor及AOX1基因啟動子和終止信號的調(diào)控下，利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)高密度培養(yǎng)后