枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶菌株的構建與發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化.pdf

1、中性蛋白酶A作為微生物酶制劑，在食品、畜牧、皮革加工和醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應用?？莶菅挎邨U菌（B. subtilis）能夠表達和分泌胞外中性蛋白酶A（NprE），但是由于細胞固有的基因表達調控機制的限制，野生型B. subtilis在生長過程中，中性蛋白酶A的表達和分泌量有限，不能滿足實際應用的需要。本研究采用基因操作技術，初步構建了能夠過量表達和分泌中性蛋白酶A的重組B. subtilis，并對重組菌的中性蛋白酶A發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。

2、
　　將B. subtilis中性蛋白酶A基因nprE的編碼序列和終止子序列，與人工表達盒PAE拼接，重組了能使中性蛋白酶A組成型表達的PAE-nprE基因。將PAE-nprE基因與大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pHP13連接，構建了中性蛋白酶A表達質粒pHP13N。
　　將質粒pHP13N分別轉化B. subtilis DB104及其衍生菌株BDY2、BDY3、BDY4和BDY5；同時也轉化了B. subtilis168及

3、其衍生菌株BN。使用脫脂牛奶培養(yǎng)基，對轉化子表達和分泌蛋白酶的能力進行了初步篩選和比較，結果發(fā)現(xiàn)，在B. subtilis DB104及其衍生菌株的轉化子中，都能篩選到在脫脂牛奶培養(yǎng)基形成大水解圈的菌株；而在B. subtilis168及其衍生菌株的轉化子中，不能篩選到形成大水解圈的菌株。這一現(xiàn)象表明，中性蛋白酶A在DB104及其衍生菌株中，能夠更有效地表達和分泌。
　　以B. subtilis BDY2/pHP13N為試驗菌株，

4、進行中性蛋白酶A發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。根據(jù)單因素實驗結果，確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖、玉米漿干粉、烘焙豆粉、磷酸鹽、MgSO4、ZnSO4、CaCl2和Tween-80。通過Plackett-Burman試驗設計，確定了玉米漿干粉和Tween-80是中性蛋白酶A發(fā)酵的極顯著因素，葡萄糖、MgSO4和ZnSO4是顯著因素。通過最陡爬坡試驗，以及中心組合設計的響應面優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖24 g/L、玉米漿干粉18 g/L、烘