重組人DNaseⅠ在大腸桿菌中的表達(dá)與分離純化.pdf

1、DNase I是發(fā)現(xiàn)最早的一種特異性DNA水解酶，在Ca2+和Mg2+等二價金屬離子存在的中性pH值條件下水解雙鏈DNA生成5’磷酸末端和3’羥基末端的寡核苷酸。DNaseⅠ在發(fā)現(xiàn)伊始僅被單純的視為一種消化酶，參與食物來源DNA的降解。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)DNaseⅠ與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死染色質(zhì)降解及系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胃腸道腫瘤和心肌梗死發(fā)生密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)克隆人DNaseⅠ基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。主要研究內(nèi)容如下：

2、 ⑴選用大腸桿菌的偏愛密碼子化學(xué)合成人DNaseⅠ基因，在其5’端和3’端分別引入BamH I和Sac I位點(diǎn)。此基因先連入克隆載體pGEM-T，測序正確后，再連入pET-22b（+）表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-22b-hDNASE。將構(gòu)建的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosettatm（DE3），篩選陽性克隆即獲得基因工程菌。 ⑵研究了此基因工程菌在不同誘導(dǎo)溫度、不同誘導(dǎo)時間、不同IPTG濃度，不同氨芐濃度和不同pH值

3、對融合蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度37℃時蛋白表達(dá)量最高，隨時間的增加蛋白表達(dá)逐漸增加，3h融合蛋白表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的52．6%；當(dāng)IPTG濃度為0．5mmol/L時蛋白表達(dá)量最高；氨芐濃度的變化對融合蛋白表達(dá)無顯著影響；pH值為中性時最高。 ⑶融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布與培養(yǎng)條件相關(guān)。當(dāng)37℃誘導(dǎo)時，融合蛋白主要以包涵體形式存在；而用LB培養(yǎng)，20℃誘導(dǎo)過夜時，融合蛋白主要分布在細(xì)胞周質(zhì)中，并且具有生物活性。針對這兩種表

4、達(dá)模式，分別使用不同的分離純化工藝。包涵體經(jīng)變性復(fù)性，再采用DEAE-Sepharose弱陰離子交換層析純化，硫酸銨沉淀濃縮后再通過Sephadex G-75分子篩收集活性組分，得到了純度為98%的thDNaseⅠ，產(chǎn)量為225mg/L，酶活為592．2U/mg；20℃誘導(dǎo)的細(xì)菌在細(xì)胞破碎后離心收集上清，硫酸銨沉淀濃縮后采用DEAE-Sepharose弱陰離子交換層析純化，再經(jīng)硫酸銨沉淀濃縮，最后通過Sephadex G-75分子篩收集