微生物的利用-大腸桿菌的培養(yǎng)與分離

1、微生物的利用,1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離2分離以尿素為氮源的微生物,大腸桿菌的培養(yǎng)和分離,實驗目的實驗原理實驗器具與材料實驗步驟實驗結果和結論知識拓展,實驗目的,利用LB液體培養(yǎng)基進行大腸桿菌的擴增培養(yǎng)的操作利用LB固體平面培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)進行大腸桿菌的分離說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理,,實驗原理,培養(yǎng)基大腸桿菌LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基劃線分離法菌種的低溫保存無菌技術,培養(yǎng)基,一、培養(yǎng)基定義及營養(yǎng)成分

2、1、定義 人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配置出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質，稱為培養(yǎng)基。2、營養(yǎng)成分 培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質包括水、無機鹽、碳源、氮源、生長因子等,,2、營養(yǎng)成分① 碳源為微生物提供碳元素的物質，可分為有機碳源和無機碳源。如 CO2、NaHCO3 等無機碳源；糖類、石油、花生粉餅等有機碳源，異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源；單質碳不能作為碳源。注意：碳源&能源的辨析,2、

3、營養(yǎng)成分② 氮源為微生物提供氮元素的物質，可分為有機氮源和無機氮源。有機氮源包括牛肉膏，蛋白胨等，無機氮源包括 N2、NH3、NH4+、NO3-等，只有固氮微生物才能利用 N2。,2、營養(yǎng)成分③ 生長因子通常指那些微生物生長所必需而且需要量很小，自身不能合成或合成量不足機體生長需要的有機化合物。一般可分為維生素、氨基酸、嘌呤與嘧啶這三類。,2、營養(yǎng)成分④ 無機鹽無機鹽是微生物生長、代謝必不可少的一類營養(yǎng)物質。無機鹽

4、生理功能主要是：作為酶活性中心的組成部分；構成微生物細胞的各種組分；調節(jié)并維持細胞的滲透壓平衡、調節(jié)pH和控制細胞的氧化還原位；作為某些微生物生長的能源物質。常見種類：磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物，以及含有鈉、鉀、鈣、鎂、鐵等金屬元素的化合物。,2、營養(yǎng)成分注意：①這幾類營養(yǎng)成分不一定都需要一一單獨添加。②不是所有培養(yǎng)基都必須同時含有碳源、氮源、水、無機鹽、生長因子。,二、培養(yǎng)基的類型,1、按照物理性質劃分液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)

5、基，半固體培養(yǎng)基2、按照成分劃分天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基3、按照用途劃分基礎培養(yǎng)基，加富培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基，鑒別培養(yǎng)基,a.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑，配置成液體狀態(tài)。 應用：在用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物時，通過振蕩或攪拌可以 增加培養(yǎng)基的通氣量，同時使營養(yǎng)物質分布均勻。液體培養(yǎng)基常用于大規(guī)模工業(yè)生產，以及在實驗室進行微生物的基礎理論和應用方面的研究。,b.固體培養(yǎng)基：加入較多凝固劑，配置成固體狀態(tài),主要用于 獲取單菌落，并對

6、微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏等。 常用的凝固劑有瓊脂、明膠、和硅膠。 絕大多數(shù)微生物而言，瓊脂是最理想的凝固劑，由藻類( 海產石花菜)中提取的一種復雜多糖；明膠是由膠原蛋白制備得到的產物，是最早用來作為凝固劑的物質；硅膠是由無機的硅酸鈉等制成的膠體。,,c.半固體培養(yǎng)基：加入較少凝固劑，培養(yǎng)基中瓊脂含量一般為 0.2％—0.7%。 應用：可用于觀察微生物的運動特征、分類鑒定等。 1、按照物理性質劃分 考點：注意固體&a

7、mp;液體培養(yǎng)基的判斷 關鍵字：液體培養(yǎng)基：振蕩、大規(guī)模工業(yè)生產等 固體培養(yǎng)基：凝固劑、平板、單菌落等,,天然培養(yǎng)基：這類培養(yǎng)基含有化學成分還不清楚或化學成分不恒定的天然有機物，也稱非化學限定培養(yǎng)基。 （因為天然有機物成分是十分混雜不穩(wěn)定的。）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基就屬于此類?；蚩寺〖夹g中常 用的LB(Luria—Bertani)培養(yǎng)基也是一種天然培養(yǎng)基。 常用的天然有機營養(yǎng)物質包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆

8、芽汁 、玉米粉、土壤浸液、麩皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡蘿卜汁、椰 子汁等，嗜糞微生物可以利用糞水作為營養(yǎng)物質。 應用：天然培養(yǎng)基成本較低，除在實驗室經常使用外，也適于用來進行工業(yè)上大規(guī)模的微生物發(fā)酵生產。,,合成培養(yǎng)基：是由化學成分完全了解的物質配制而成的培養(yǎng)基，也稱 化學限定培養(yǎng)基。高氏I號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基就屬于此種類型。 應用：配制合成培養(yǎng)基時重復性強，但與天然培養(yǎng)基相比其成本較高 ，微生物在其中生長速度較慢

9、，一般適于在實驗室用來進行有關微生 物營養(yǎng)需求、代謝、分類鑒定、生物量測定、菌種選育及遺傳分析等方面的研究工作。,①基礎培養(yǎng)基： 含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 應用：基礎培養(yǎng)基可以用來作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分。②加富培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質制成 的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，用來培養(yǎng)營養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)型微生物。 這些特殊營養(yǎng)物質包括血液、血清、酵母浸膏、動植物組織 液

10、等。 應用：加富培養(yǎng)基可以用來培養(yǎng)營養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)型微生物，以及從環(huán)境中富集和分離某種微生物。,,③鑒別培養(yǎng)基： 是用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。 在培養(yǎng)基中加入某種特殊化學物質，某種微生物在培養(yǎng)基中 生長后能產生某種代謝產物，而這種代謝產物可以與培養(yǎng)基 中的特殊化學物質發(fā)生特定的化學反應，產生明顯的特征性變化，根據(jù)這種特征性變化，可將該種微生物與其他微生物 區(qū)分開來。 應用：鑒別培養(yǎng)基主要用于微生物的快速分類鑒定，以及分離

11、和篩選產生某種代謝產物的微生物菌種。 常見例子：伊紅-美藍培養(yǎng)基，鑒別大腸桿菌，使其出現(xiàn)帶金屬光澤深紫色菌落。 剛果紅培養(yǎng)基，鑒別能分解纖維素的微生物，在這里微生物周圍形成透明圈。,,④選擇培養(yǎng)基： 用來將某種或者某類微生物，從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基。 根據(jù)不同種類微生物的特殊營養(yǎng)需求或對某種化學物質的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入相應的特殊營養(yǎng)物質或化學物質 ，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長。常見類型： a

12、.依據(jù)某些微生物的特殊營養(yǎng)需求設計 如：利用以纖維素或石蠟油作為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，可以從混雜的微生物群體中分離出能分解纖維素或石蠟油的微生物 ; 利用以蛋白質作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以分離產胞外蛋白酶的微生物 ; 缺乏氮源的選擇培養(yǎng)基可用來分離固氮微生物。,b.在培養(yǎng)基中加入某種化學物質 , 這種化學物質沒有營養(yǎng)作用 , 對所需分離的微生物無害 , 但可以抑制或殺死其他微生物 。 如 ：在培養(yǎng)基中加入青霉素、 四環(huán)素或鏈霉素 ,

13、 可以抑制細菌 和放線菌生長 , 而將酵母菌和霉菌分離出來。 現(xiàn)代基因克隆技 術中也常用選擇培養(yǎng)基 , 篩選含有重組質粒的基因工程菌株。 在培養(yǎng)基中加入高濃度的NaCl可得到金黃色葡萄球菌。注意：有的培養(yǎng)基可以同時是選擇+鑒別培養(yǎng)基 當要分離金黃色葡萄球菌時 , 在培養(yǎng)基中加入 7.5%NaCl 、甘露糖醇和酸堿指示劑 。 金黃色葡萄球菌可耐高濃度 NaCl, 且能利用甘露糖醇產酸。因此 ，能在上述培養(yǎng)基生長，而且菌落周圍培養(yǎng)基顏色

14、發(fā)生變化，則該菌落有可能是金黃色葡萄球菌 , 再通過進一步鑒定加以確定。,,除上述四種主要類型外，培養(yǎng)基按用途劃分還有很多種，比如：分析培養(yǎng)基 常用來分析某些化學物質 ( 抗生素、維生素 ) 的濃度，還可用來分析微生物的營養(yǎng)需求；還原性培養(yǎng)基 專門用來培養(yǎng)厭氧型微生物；組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基含有動、植物細胞 , 用來培養(yǎng)病毒、 衣原體 、立克次 氏體等專性活細胞寄生的微生物。 盡管如此 , 有些病毒和立克次氏體目前還不能利用人工培養(yǎng)基來培

15、 養(yǎng) , 需要接種在動植物體內、 動植物組織中才能增殖。常用的培養(yǎng)病毒與立克次氏體的動物有小白鼠、家鼠和豚鼠 , 雞胚也是培養(yǎng)某些病毒與立克次氏體的良好營養(yǎng)基質 。,第一題,,大腸桿菌是革蘭氏陰性兼性厭氧的腸道桿菌，原核生物，以二分裂方式繁殖。,細菌是單細胞的原核生物。細菌細胞的結構有細胞壁、細胞膜、細胞質等。細菌無成型的細胞核，細胞壁由肽聚糖組成。由于細菌細胞壁結構不同，細菌可分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩類。革蘭氏陽性菌細胞壁厚，

16、無莢膜，多產生外毒素；革蘭氏陰性菌細胞壁薄，有莢膜，多產生內毒素。革蘭氏陽性菌對青霉素更為敏感。 大腸桿菌是革蘭氏陰性、異養(yǎng)兼性厭氧型腸道桿菌。在腸道中一般對人無害，但任何大腸桿菌進入人的泌尿系統(tǒng)，都會對人體產生危害。大腸桿菌在基因工程技術中被廣泛的應用，它的質粒是最常用的運載體，它也是基因工程中常用的受體細胞。,,LB液體培養(yǎng)基 擴大培養(yǎng)大腸桿菌LB固體平面培養(yǎng)基 劃線分離培養(yǎng)大腸桿菌,劃線分離法,通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面

17、，連續(xù)劃線，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，形成單菌落，單菌落的分離是消除污染雜菌的通用方法，也是篩選高表達量的最簡便方法之一,無菌技術,1、定義指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施。目的：防止外來雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物。,2、實現(xiàn)無菌的常用方法 消毒 滅菌① 消毒：采用相對較為溫和物理或化學方法，殺死物體表面或內部部分的微生物（不包括芽孢和孢子）。

18、常見的消毒方法：煮沸消毒法、紫外線消毒法、巴氏消毒法以及利用化學藥品消毒等,② 滅菌： 指用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物（包括芽孢和 孢子）。 常見的滅菌方法：灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌等,,3、主要內容 主要包括三個方面： 無菌環(huán)境設施、無菌實驗器材、無菌操作方法① 無菌環(huán)境設施： 無菌環(huán)境只是相對而言，指人們利用物理的方法或化學的方法，在某一可控制空間內使微生物數(shù)量降低至最低限度，接近于無菌的一種空間

19、。 主要方法：無菌室 無菌柜 超凈工作臺,② 無菌實驗器材： 凡是實驗中使用的器材，能滅菌處理的必須滅菌。如玻璃器皿 （包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、試管等）、培養(yǎng)基、無菌衣 、口罩等，無法滅菌處理的，使用前必須經消毒處理，例如無菌室內的凳、試管架、天平等，這些雖然無法滅菌，但是可以消毒，可用化學藥品熏蒸、噴灑或擦拭。,③ 無菌操作方法： a.對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒; b.將用于微生物培養(yǎng)的器皿

20、、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌; c.為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行; 注意：通常，可在酒精燈旁進行實驗；小規(guī)模的操作可以使用無菌箱或超凈工作臺，工作量大的使用無菌室，要求嚴格的可在無菌室內再結合使用超凈工作臺。d. 實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸； e. 使用過的培養(yǎng)基及培養(yǎng)物等必須經過滅菌處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴散；,培養(yǎng)基的配制,培養(yǎng)基的配制原則① 選擇適宜

21、的營養(yǎng)物質 總體而言，所有微生物生長繁殖均需要培養(yǎng)基含有碳源、氮 源、無機鹽、生長因子、水及能源，但由于微生物營養(yǎng)類型復 雜，不同微生物對營養(yǎng)物質的需求是不一樣的，因此首先要根 據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需求配制針對性強的培養(yǎng)基。 ② 營養(yǎng)物質濃度及配比合適 培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質濃度合適時微生物才能生長良好，營養(yǎng)物質濃度過低時不能滿足微生物正常生長所需，濃度過高時則 可能對微生物生長起抑制作用。,,③ 控制pH條件 各類微生物生長繁殖或產生代謝產

22、物的最適pH條件各不相 同，一般來講，細菌與放線菌適于在pH7～7.5范圍內生長，酵母菌和霉菌通常在pH4.5～6范圍內生長。 值得注意的是，在微生物生長繁殖和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質被分解利用和代謝產物的形成與積累，會導致培養(yǎng)基pH發(fā)生變化，若不對培養(yǎng)基pH條件進行控制，往往導致微生物生長速度下降或(和)代謝產物產量下降。因此，為了維持培養(yǎng)基pH 的相對恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，常用的緩沖劑是 一氫和二氫磷酸鹽(如KH2PO

23、4 和K2HPO4)組成的混合物。 ④ 滅菌處理,,培養(yǎng)基的配制流程以牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基為例： 計算→稱量→溶(熔)化→調pH→滅菌→倒平板① 計算：根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例，計算制作 100mL 的培 養(yǎng)基時，各種成分的用量。② 稱量：準確地稱取各種成分。 ③ 溶化：將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯，加入少量的水， 加熱。當牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。往燒杯中加入稱量好的蛋白胨和氯化鈉，用

24、玻璃棒攪拌，使其溶解。加入 瓊脂加熱使其熔化。在此過程中不斷用玻璃棒攪拌，防止瓊脂糊底而 導致燒杯破裂。當瓊脂完全熔化后，補加蒸餾水至 100mL。,④ 調 pH：培養(yǎng)霉菌時需將 pH 調至酸性，培養(yǎng)細菌時需將 pH 調至中性。 ⑤ 滅菌： 將配制好的培養(yǎng)基轉移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，放入高壓滅菌鍋，在壓力為 100kPa，溫度為 121℃的條件下，滅菌 15～30min。 滅菌： 注意事項： a.滅菌的主要因素是溫度而

25、不是壓力。因此高壓鍋內冷空氣必須完全排盡后，才能關上排氣閥，維持所需壓力; b.滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力 表的壓力降至“0”時，打開排氣閥，打開蓋子，取出滅菌物品。,⑥ 倒平板： 待培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。 倒平板操作： a.將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形 瓶，左手拔出棉塞； b.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰； c.用左手將培養(yǎng)皿打開

26、一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培 養(yǎng)基（約 10～20mL）導入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋； d.等待平板冷卻凝固后，將平板倒置過來放置，使皿蓋朝下，皿底在上。,有關倒平板的操作錯誤的是（ ）A． 將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上 B． 使打開的錐形瓶瓶口迅速通過火焰 C． 將培養(yǎng)皿打開，培養(yǎng)皿蓋倒放在桌子上 D． 等待平板冷卻凝固后需要倒過來放置A、將過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，防止培養(yǎng)皿被污染，A正

27、確；B、使打開的錐形瓶瓶口迅速通過火焰，對錐形瓶的口徑處進行灼燒滅菌，防止空氣中的雜菌污染，B正確；C、倒平板時不能把培養(yǎng)皿蓋完全打開并放到桌面上，這樣會污染培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，C錯誤；D、倒平板后冷卻需要倒過來放置，防止皿蓋上的水珠滴落到培養(yǎng)基上，D正確．故選：C．,（為什么要倒平板）,下列操作屬于滅菌方法的是（ ） A．接種前用酒精棉球擦拭雙手和工作臺面B．接種中試管口等易被污染的部位通過火焰 C．牛奶在 80℃下

28、煮 15min 以殺死其中的微生物 D．氯化汞溶液浸泡外植體 1～2min 后無菌水沖洗B巴氏消毒化學藥劑消毒,關于滅菌和消毒的不正確理解是（ ） A． 滅菌是指殺滅環(huán)境中的一切微生物包括芽孢和孢子 B． 消毒和滅菌實質上是相同的，都能殺死一切微生物 C． 接種環(huán)用灼燒法滅菌 D． 常用消毒、滅菌方法有加熱法、過濾法、紫外線法、化學藥物法B、消毒是指消除或殺滅外環(huán)境中的病原體，使其無害化，滅菌則是要將所有的微生物和

29、病毒全部殺滅，以達到無菌的目的，滅菌一定可以達到消毒的目的，但消毒不一定能達到滅菌的效果，B錯誤；C、接種工具常用灼燒法滅菌，C正確；D、常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線或化學藥物消毒法等，滅菌可以采用高溫蒸汽滅菌法，D正確．故選：B．,消毒和滅菌是兩個不同的概念，滅菌是指徹底殺滅微生物使其永遠 喪失生長繁殖的能力．消毒僅指殺死一部分對人體有害的病原菌而 對被消毒的物體基本無害．下列哪些事物適用于消毒處理（ ）

30、①皮膚 ②飲用水 ③牛奶 ④注射器 ⑤培養(yǎng)皿 ⑥接種環(huán) ⑦培養(yǎng)基 ⑧果汁 ⑨醬油 ⑩手術刀 A． ①②③⑧⑨ B． ④⑤⑥⑦⑩ C． ①②④⑤⑥⑧ D． 以上全部,消毒指用比較溫和的方法殺死微生物的營養(yǎng)細胞，適用于那些不耐高溫的液體．如③牛奶、⑧果汁、⑨醬油，這樣可以使其中的營養(yǎng)成分不被破壞．另外對要求不是很嚴格的①皮膚、②飲用水也用消毒的方法處理．而對于嚴格要求的④注射器、⑤培養(yǎng)皿、⑥接種環(huán)、⑦培養(yǎng)基、⑩手術刀等必須進行滅菌處理

31、．所以，①②③⑧⑨應該用消毒的方法處理．故選：A．,（1）在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，除考慮營養(yǎng)條件外，還要考慮 ____ 、 ____ 和滲透壓等條件。由于該細菌具有體積小、結構簡單、變異類型 容易選擇、 ______ 、 _____ 等優(yōu) 點，因此常作為遺傳學研究的實驗材料。 （2）在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和培 養(yǎng)器皿進行____(消毒、滅菌)；操作者的雙手需進行清洗和_____； 靜止空氣中的細菌可用紫外

32、線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質變性 ，還能 _______ 。（3）若用稀釋涂布平板法計數(shù)大腸桿菌活菌的個數(shù)，要想使所得估計值更接近實際值，除應嚴格操作、多次重復外，還應保證待測樣品稀釋的_______。（3）通常，對獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小，顏色等菌落特 征對細菌進行初步的 _________ 。 （4）培養(yǎng)大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養(yǎng)基是否被污染。對于 固體培養(yǎng)基應采用的檢測方法是 ________ 。

33、（5） 若用大腸桿菌進行實驗，使用過的培養(yǎng)基及培養(yǎng)物必須經過 ________ 處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴散。1 溫度 酸堿度 易培養(yǎng) 生活周期短2 滅菌 消毒 損傷DNA結構3比例合適 3鑒定 和分類 4將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時間觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產生。5滅菌,,實驗器具與材料,主要器具高壓蒸汽滅菌鍋，三角瓶，封口膜，培養(yǎng)皿，接種瓶，恒溫培養(yǎng)箱，搖床，酒精燈，超凈臺，裝有酒精棉球的廣口瓶，鑷子，

34、試管，棉塞，主要材料LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨+酵母提取物+氯化鈉+水）LB固體培養(yǎng)基（蛋白胨+酵母提取物+氯化鈉+瓊脂+水）空白斜面，大腸桿菌菌種斜面（保存在斜面培養(yǎng)基上的大腸桿菌）,,實驗步驟,1培養(yǎng)基的配置2大腸桿菌的擴大培養(yǎng)3大腸桿菌的劃線分離培養(yǎng)4大腸桿菌的保存培養(yǎng)5實驗結果與結論,1培養(yǎng)基的配置,1．稱量：準確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基時還需

35、加1g瓊脂。 (培養(yǎng)基中添加凝固劑如瓊脂，一般不能被微生物利用，只能起到凝固作用）2．溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時還需加瓊脂，整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。 3．調pH：用1mol/L NaOH溶液調節(jié)pH至偏堿性。,4．滅菌：在兩個250ml的三角瓶中分別裝入50ml LB液體培養(yǎng)基和50ml LB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內，1kg壓力滅

36、菌15min。 5．倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。其過程是：①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；③用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。 倒過來放置的目的是防止培養(yǎng)基冷卻過程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。向培養(yǎng)皿中轉移已滅菌的培養(yǎng)基

37、時，也不要把培養(yǎng)基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會在這些粘附培養(yǎng)基上繁殖，并污染皿內培養(yǎng)基。,滅菌和消毒,1．無菌技術：①對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；②將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌；③為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰旁進行；④避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。 2．消毒方法：①日常生活經常用到的是煮沸消毒法；②對一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法；③對接種室、接種箱或超凈工作臺

38、首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強消毒效果，然后使用紫外線進行物理消毒；④實驗操作者的雙手使用酒精進行消毒。 3．滅菌方法：①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；②培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；③表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。,比較消毒和滅菌：,注意事項：①實驗中用的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。滅菌后，通常在60～80℃烘箱中除去滅菌時的水分；

39、②物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開排氣閥，煮沸并排除鍋內冷空氣，其目的是有利于鍋內溫度升高，隨后關閉排氣閥繼續(xù)加熱，加熱結束切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務必降至零時打開鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸；③在用任何器皿轉接時，瓶塞和封口膜只能夾在手上，不許放在臺面上，接種時要在酒精燈火焰旁操作；④培養(yǎng)基一定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養(yǎng)皿壁上，否則容易污染；⑤接種時要膽大心細，動作快捷，這是減少污染的關鍵；⑥接種后

40、，培養(yǎng)皿必須倒放（蓋在下方）在恒溫培養(yǎng)箱中，如正放則水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到接種后的培養(yǎng)基表面，水流擴散會使菌落擴散，就很難形成單菌落了。,2大腸桿菌的擴大培養(yǎng),將保存大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角瓶放在左手中，靠近酒精燈火焰，右手拿著接種環(huán)，并用無名指和小指家住斜面的棉塞和三角瓶封口膜，將接種環(huán)在火焰上燒紅，冷卻后取斜面上的單菌落菌體放入三角瓶的液體培養(yǎng)集中，并用封口膜封口，在37度，每分鐘200轉的搖床上振蕩培養(yǎng)12小時。,3

41、大腸桿菌的劃線分離培養(yǎng),1．劃線分離法：用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過程中菌液逐漸減少，細菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細菌間的距離加大。在培養(yǎng)10～20h后，可由一個細菌產生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細菌產生的后代。,其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時，用環(huán)狀

42、接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 3～5條，轉動培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。,灼燒的目的取菌種

43、前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細菌污染環(huán)境和操作者涂布分離法：先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋到10－5 ～10－7之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進行培養(yǎng)，在適當?shù)南♂尪认?，可產生相互分開的菌落。通常每

44、個培養(yǎng)皿有20個以內的單菌落最為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養(yǎng)后，再做功能性實驗。劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復雜些。細菌的兩種分離法各有優(yōu)點,都可采用。,4 大腸桿菌的保存培養(yǎng),在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在空白斜面上，在37度下培養(yǎng)24小時，置于4度的冰箱中保存。菌種放在低溫環(huán)境中保存的目的是為了降低微生物的新陳代謝速率，延緩菌種細胞的衰老。,5 實驗結果,在37度恒

45、溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24小時后，看到劃線的開始，菌落連續(xù)，說明大腸桿菌在液體培養(yǎng)基里得到了大量擴增，看到劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落，表明大腸桿菌已被分離。,,五、菌落和菌種種類的辨認,單個細菌用肉眼是看不見的，但是，當單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，便會形成一個肉眼可見的、具有一定形態(tài)結構的子細胞群體，叫做菌落。不同種類的細菌所形成的菌落在大小、形狀、顏色、光澤度、透明度等方面具有一定的特征。 細菌的菌落表面一般是光滑而

46、濕潤的，有黏稠性，多數(shù)透明或半透明，但也有細菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細的菌絲并可產生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅實多皺，長孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環(huán)挑動；酵母菌落類似于細菌菌落，表面光滑而濕潤，有黏稠性但大多呈乳白色，少數(shù)呈紅色。 如果菌落無法辨認，只有借助于顯微鏡觀察。在顯微鏡下細菌一般為桿狀、球狀和弧狀，直徑都在1um左右；