吉大畜牧院《基因工程》復習資料

1、1第一章第一章緒論緒論1.基因工程的定義：基因工程的定義：在體外對不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA)，轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細胞內(nèi)進行無性繁殖，并表達出基因產(chǎn)物。2.基因工程理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術上的三大發(fā)現(xiàn)基因工程理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術上的三大發(fā)現(xiàn)3.基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟（1）目的基因的獲取：從復雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶

2、有目的基因的DNA片斷。（2）重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復制并帶有選擇性標記（抗菌素抗性）的載體分子上。（3）重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當?shù)氖荏w細胞中。（4）克隆鑒定：挑選轉(zhuǎn)化成功的細胞克隆（含有目的基因）。（5）目的基因表達：使導入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產(chǎn)物。4.基因工程的意義基因工程的意義（1）基因工程在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；轉(zhuǎn)基因植物；轉(zhuǎn)基

3、因動物。（2）基因工程在工業(yè)中的應用：1）纖維素的開發(fā)利用：克隆各種參與纖維素降解的酶的基因，導入釀酒酵母，就可能利用廉價的纖維素來生產(chǎn)葡萄糖，發(fā)酵成酒。2）釀酒工業(yè)：用外源基因改造釀酒酵母，產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的啤酒。或用釀酒酵母生產(chǎn)蛋白質(zhì)等。（3）基因工程在醫(yī)藥上的應用：用微生物生產(chǎn)藥物；用轉(zhuǎn)基因植物或動物生產(chǎn)藥物；設計高效高特異性的生物制劑疫苗；制造新型疫苗；基因診斷；法醫(yī)鑒定；基因治療。（4）基因工程在環(huán)境保護中的作用：1）檢測水污染：用重

4、組細菌或轉(zhuǎn)基因魚等檢測水污染2）生物降解：用帶有重組質(zhì)粒的“超級菌”分解油（烷烴類）、有機農(nóng)藥污染。（5）基因工程商業(yè)化的發(fā)展第二章第二章基因工程主要技術原理基因工程主要技術原理1質(zhì)粒和基因組質(zhì)粒和基因組DNA的提取方法與純化步驟，主要試劑是什么的提取方法與純化步驟，主要試劑是什么質(zhì)粒的提取和純化方法質(zhì)粒的提取和純化方法最常用的為堿抽提法：原理：閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復性快。染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后

5、雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結(jié)構，與蛋白質(zhì)SDS復合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。步驟：1）溶菌：溶液I（50mM葡萄糖，25mMTrisHCl，10mMEDTA45mgml溶菌酶）2）破膜：溶液II（0.2NNaOH1.0%SDS）3）中和：溶液III（3M醋酸鈉pH4.8）4）離心5）轉(zhuǎn)移：將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中6）抽提：酚氯仿抽提，酚氯仿異戊醇—252417）沉淀：用0.6倍體積的異戊醇或2倍體積的乙醇（可以加入11

6、0體積的3M醋酸銨輔助沉淀）基因組基因組DNA的提取純化方法的提取純化方法3Tm也受介質(zhì)中離子強度的影響，離子強度低，熔解溫度也低。復性復性：在適當條件下，變性DNA的兩條互補單鏈重新結(jié)合，形成雙鏈的過程稱為復性。在熱變性后，當溫度緩慢冷卻至比Tm值低2030℃時，變性的單鏈DNA即可恢復雙鏈螺旋結(jié)構，這樣的復性又稱為退火。預雜交：預雜交：為了減少探針與廣泛存在的非互補核酸的非特異性結(jié)合，在雜交前可用封閉物將這些非特異位點封閉。在雜前的

7、這些處理過程稱為預雜交類型類型：根據(jù)核酸的來源、種類和形式分為Southernblot，Nthernblot，菌落原位雜交，斑點雜交，組織原位雜交Southernblot：DNA分子—限制性酶切為限制片段—瓊脂糖凝膠電泳—NaOH變性—轉(zhuǎn)膜固定—雜交—顯影Nthernblot：提取T、Cell總RNA—提純分離mRNA—瓊脂糖凝膠電泳分離RNA—轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜—雜交檢測斑點雜交：斑點雜交：其原理與步驟與Southern印跡雜交相似，

8、所不同的是不進行核酸的酶解和電泳分離，直接將變性的DNA或RNA加到固相載體上。菌落菌落噬菌斑原位雜交：噬菌斑原位雜交：直接將菌落(噬菌斑)原位轉(zhuǎn)移到固相載體上，不必進行核酸的分離純化、酶解和電泳分離。溶菌(噬菌斑)變性后直接進行特異核酸（DNA或RNA）分子的雜交技術，結(jié)果直接找出相應的陽性重組子菌落(噬菌斑)。組織組織細胞原位雜交：細胞原位雜交：用標記的已知核酸序列為探針，使其與細胞、組織、染色體或切片中核酸進行雜交檢測的方法稱為原

9、位雜交。原位雜交的類型：DNADNA、DNARNA、RNARNA雜交?；蛐酒夯蛐酒夯蛐酒侵笇⒋罅刻结樂肿庸潭ㄓ谥С治锷?，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布進而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息。6.PCR概念、概念、PCR技術的基本原理及特點、引物設計要求及常見問題技術的基本原理及特點、引物設計要求及常見問題PCR概念：概念：應用聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）技術，

10、在體外特異性地擴增某個基因。PCR技術的基本原理：技術的基本原理：類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個基本反應步驟構成。變性：升高溫度使模板DNA變性、雙鏈分開。退火：再降低溫度使引物與模板DNA配對互補結(jié)合。延伸：然后升溫到聚合酶反應適宜的溫度，此時在聚合酶催化下，從引物3’羥基端開始，與模板DNA上的堿基配對逐個加上核苷酸，合成新的DNA鏈。循環(huán)：其后再按高溫變性、低溫退

11、火、適溫合成三步反復循環(huán)，新合成的DNA在下一循環(huán)中又作為模板使用，每循環(huán)一次，合成的目的序列擴增一倍。經(jīng)過多次循環(huán)使DNA含量顯著提高。特點：特點：靈敏度高、特異性強、快速檢測、定量準確、重復性好特異性強PCR反應的特異性決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②堿基配對原則；③TaqDNA聚合酶合成反應的忠實性；④靶基因的特異性與保守性。引物設計要求：引物設計要求：?引物長度（length）:20～30bp?GC含量以4060