基因工程

1、1、基因工程：在體外對不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進(jìn)行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細(xì)菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA)，轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，并表達(dá)出基因產(chǎn)物。2、1973年斯坦福大學(xué)的S.Cohen小組把非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)。3、基因工程的安全措施：（1）實(shí)驗(yàn)室的物理安全：P1P4級實(shí)驗(yàn)室（2）實(shí)驗(yàn)室的生物安

2、全：①EK1級的大腸桿菌、②EK2EK3級大腸桿菌、（3）載體的安全：應(yīng)該是失去了自我遷移的能力。4、第一個(gè)基因重組做出的藥物胰島素5、限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。6、修飾限制系統(tǒng)的兩種酶：甲基化酶和限制性內(nèi)切酶。(Dam甲基化酶在A堿基上引入Dcm在C堿基上引入）7、同裂酶：識別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。分為完全同裂酶（識別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相

3、同）與不完全同裂酶（識別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同）XmaI5’C?CCGGG3’SmaI5’CCC?GGG3’3’GGG?CCC5’3’GGGCC?C5’同尾酶：識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。星號（）活性：如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（）活性。8、限制性內(nèi)切酶的命名：1.用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語表示寄主菌的物種名。2.用一個(gè)右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如EcokEc（現(xiàn)在都

4、寫成平行，如EcI）。3.如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcI，EcV。9、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：DNA的純度、DNA的甲基化程度、溫度、緩沖液10、如何實(shí)現(xiàn)局部消化：通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。11、常用限制酶識別位點(diǎn)PstI：CTGCAGGACGTC質(zhì)粒的空間構(gòu)型：①共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)（呈超螺旋SC）；②開環(huán)DNA（opencircul

5、ar，ocDNA）；③線形DNA（linear，lDNA）電泳速率：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢25、核酸外切酶DNA外切酶外切酶切割方式切割方式識別位點(diǎn)識別位點(diǎn)大腸桿菌核酸外切酶大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）5’?3’5’OH單鏈單鏈大腸桿菌核酸外切酶大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’?3’3’?5’5’P3’OH核酸外切酶核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’?5’3’OH?核酸外切酶（核酸外切酶（?exo）5’?3’5’

6、P雙鏈雙鏈T7基因基因6核酸外切酶核酸外切酶5’?3’5’P5’OH29、氨芐青霉素是青霉素的衍生物?？剐栽恚篈mpr基因編碼β內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的β內(nèi)酰胺環(huán)。30、表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)（1）普通載體元件：復(fù)制起始點(diǎn)I、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)MCS（2）大腸桿菌操縱子元件：阻遏基因I、操縱基因O、啟動(dòng)基因P、核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）、轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。31、pBR322有兩個(gè)抗性基因篩選標(biāo)記：氨芐青霉素和四環(huán)素。32、PUC系列含

7、有一個(gè)氨芐青霉素和一個(gè)lacZ基因。（藍(lán)白菌落篩選）33、λ噬菌體的結(jié)構(gòu)：λ噬菌體是線性雙鏈DNA病毒，末端具有互補(bǔ)的12nt，稱cos位點(diǎn)。感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀。cos位點(diǎn)：線性λDNA分子的兩端各有12個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端，這個(gè)長粘性末端稱為cos位點(diǎn)。34、構(gòu)建λ噬菌體包裝的限制：不超過原噬菌體的75%105%，克隆能力23kb35、2種包裝的形式與原理：第一種方法：利用cos位點(diǎn)發(fā)生突變的λ噬菌體進(jìn)行體外包裝第二種方

8、法：為了制備體外包裝重組λDNA分子需要的各種蛋白質(zhì)，篩選到了D基因缺失的λ噬菌體突變株(D)和E基因缺失的λ噬菌體突變株(E)。當(dāng)這兩種突變株分別感染受體菌時(shí)，雖然兩者均能復(fù)制λDNA分子，但是D突變株感染的受體菌合成的系列蛋白質(zhì)中缺了D蛋白，E突變株感染的受體菌合成的系列蛋白質(zhì)中缺了E蛋白‘兩者均不能把復(fù)制的λDNA分子包裝成噬菌體顆粒，導(dǎo)致兩種受體菌細(xì)胞內(nèi)分別積累了除D蛋白或E蛋白以外的一系列與包裝相關(guān)的蛋白質(zhì)。當(dāng)這兩種受體菌細(xì)胞