第七微生物的遺傳與變異

1、第七章 微生物的遺傳變異與育種p188，(6學(xué)時(shí)),基本概念,遺傳型(genotype):表型(phenotype):,遺傳型（可能性）,+ 環(huán)境條件,,表型（現(xiàn)實(shí)性）,基本概念,什么叫變異(variation) ？,粘質(zhì)沙雷氏菌：在25℃下培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素；在37℃下培養(yǎng)，不產(chǎn)生色素；如果重新將溫度降到25℃，又恢復(fù)產(chǎn)色素的能力。,飾變（modification）：指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的

2、表型變化。不穩(wěn)定的，不可遺傳的；幾乎整個(gè)群體中的每一個(gè)個(gè)體都發(fā)生同樣的變化；性狀變化的幅度??；。,遺傳和變異的生物學(xué)意義,相互依存，二者均不可缺少通過變異，導(dǎo)致新性狀的產(chǎn)生通過遺傳，產(chǎn)生的新性狀才能穩(wěn)定，物種才能進(jìn)化,對(duì)微生物遺傳變異規(guī)律的深入研究，有助于研究和了解生物的生命活動(dòng)規(guī)律。對(duì)微生物遺傳變異規(guī)律的深入研究可為微生物育種工作提供豐富的理論基礎(chǔ)。,研究微生物遺傳變異規(guī)律的意義,本章安排,第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)第

3、二節(jié) 基因突變和誘變育種第三節(jié) 基因重組和雜交育種第四節(jié) 基因工程第五節(jié) 菌種保藏,第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),,一、證明核酸 (DNA or RNA)是遺傳物質(zhì)的三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae) 的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（1928-1944年）噬菌體的感染實(shí)驗(yàn)（1953年）煙草花葉病毒（TMV）的染色體重建實(shí)驗(yàn)（1956年）,實(shí)驗(yàn)材料：肺炎雙球菌,S型(SⅢ型)：,具莢膜,光滑（Smooth)型菌落

4、，有致病性；,不具莢膜，粗糙（Rough)型菌落，無致病性；,R 型(R Ⅱ型: S Ⅱ突變),1.肺炎雙球菌 (Diplococcus pneumoniae)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),（1）動(dòng)物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（2）細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（3）S型菌的無細(xì)胞抽提液試驗(yàn)（4）S菌中各組分的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),1. 肺炎雙球菌 (Diplococcus pneumoniae)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（1928~1944）,活S Ⅲ菌,,注射,,活R菌,,注射,,死S Ⅲ菌,,注射,

5、死S Ⅲ菌活R Ⅱ菌,,注射,,,,抽心血分離,活S Ⅲ菌+活R Ⅱ菌,（1）動(dòng)物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(griffith,1928),S Ⅲ菌,,培養(yǎng),動(dòng)物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)論,S Ⅲ菌中的某種物質(zhì)通過一定的方式轉(zhuǎn)化到活的R菌中，使R Ⅱ菌具有了穩(wěn)定地產(chǎn)生莢膜的遺傳性狀。,（2）細(xì)菌體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),（3）S型菌的無細(xì)胞抽提液試驗(yàn),以上實(shí)驗(yàn)說明：加熱殺死的S型細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進(jìn)入R型細(xì)胞并使RII型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

6、S型細(xì)胞。,熱死S菌—————不生長(zhǎng)活 R 菌—————長(zhǎng)出R菌熱死S菌—————長(zhǎng)出大量R菌和10-6S菌,活R菌+S菌無細(xì)胞抽提液——長(zhǎng)出大量R菌和少量S菌,+活R菌,平皿培養(yǎng),平皿培養(yǎng),4. S菌中各組分的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(1944,Avery等）,死 S 菌,,抽提,,,莢膜多糖,,,,,分別與活的R菌共培養(yǎng),脂類,RNA,DNA+DNA酶以外的酶,DNA+DNA酶,DNA,,,蛋白質(zhì),,,,,,,,結(jié)論：DNA是遺傳物質(zhì),

7、R菌 R菌 R菌 R菌 S菌＋R菌,DNA,,,,,R菌 S菌＋R菌,,,,,,,2. 噬菌體感染實(shí)驗(yàn),A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一組：,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,,沉淀中含25%放射性,以32S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實(shí)驗(yàn),（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中,上清液中含

8、75%放射性,,,,,,,,,（三）植物病毒的拆開和重建實(shí)驗(yàn) H. Fraenkel-Conrat（1956）,（1）TMV的拆開實(shí)驗(yàn),,苯酚,,,感染煙草,,,病斑煙葉,正常煙葉,HRV,HRV MTV,MTV,病毒的拆開和重建實(shí)驗(yàn),二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式,真核微生物原核微生物核區(qū)：核基因組核外遺傳物質(zhì)——質(zhì)粒,三、原核生物的質(zhì)粒,質(zhì)粒( plasmid ) ：是一類小型核外雙螺旋DNA分子，能獨(dú)立

9、于細(xì)胞核進(jìn)行自主復(fù)制。,（一）質(zhì)粒(plasmid)的性質(zhì),1.形狀：共價(jià)閉合環(huán)狀（少數(shù)線狀），具超螺旋結(jié)構(gòu)；（circular covalently closed DNA,cccDNA)2.大?。杭s為1kb～300kb，數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)基因。3.質(zhì)粒的存在形式-游離態(tài)-附加體：整合到核基因組上,4. 質(zhì)粒的功能：多樣化，正常生長(zhǎng)非必須的，但賦予細(xì)菌某些性狀特征5.質(zhì)粒具有自我復(fù)制的能力6.可以自我轉(zhuǎn)移,（一）質(zhì)粒(p

10、lasmid)的性質(zhì),質(zhì)?？沙蔀榛蚬こ痰妮d體,（二）質(zhì)粒的類型,按照拷貝數(shù)低拷貝數(shù)質(zhì)?；驀?yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒，高拷貝數(shù)質(zhì)?；蛩沙谛唾|(zhì)粒按照宿主范圍窄宿主范圍質(zhì)粒廣宿主范圍質(zhì)粒按照編碼的功能,質(zhì)粒的類型,1) 致育質(zhì)粒（ F因子）：與細(xì)菌有性生殖有關(guān)2) 抗性質(zhì)粒（R因子）： 與細(xì)菌對(duì)抗菌藥物或重金屬鹽類抗性有關(guān)3) 細(xì)菌素質(zhì)粒 （ Col因子）： 產(chǎn)生細(xì)菌素4) 毒力質(zhì)粒（Vi質(zhì)粒）： 編碼與該菌致病性有關(guān)的毒力因子5)

11、 降解性質(zhì)粒：編碼降解有毒物質(zhì)酶的質(zhì)粒6）Ti質(zhì)粒：誘癌質(zhì)粒，合成冠癭堿類7）Ri質(zhì)粒：誘發(fā)植物產(chǎn)生毛狀根8）巨大質(zhì)粒（mega質(zhì)粒）9) 酵母的2µ質(zhì)粒,（三）質(zhì)粒的分離制備和鑒定,制備：包括增殖、裂解細(xì)胞、分離質(zhì)粒與染色體和蛋白質(zhì)等成分、去除RNA和蛋白質(zhì)等步驟。鑒定：電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法,第二節(jié) 基因突變與育種,突變（mutation）：遺傳物質(zhì)突然發(fā)生可遺傳的變化。染色體畸變（

12、chromosomal aberration)基因突變（gene mutation）：由于一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基的缺失、插入或置換而導(dǎo)致的遺傳變化，又稱點(diǎn)突變（point mutation）。,第七章 微生物的遺傳變異與育種,突變體（mutant）：發(fā)生了突變的微生物細(xì)胞或菌株野生型（wild type）：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株,一、基因突變的類型,1、堿基變化與遺傳信息的改變同義突變（same-sense

13、 mutation）錯(cuò)義突變（mis-sense mutation）無義突變（nonsense mutation）移碼突變（frameshift mutation）,堿基變化與遺傳信息的改變,原序列：5´- AUG CCU UCA AGA UGU GGG CAA-3´多肽 Met Pro Ser Arg Cys Gly

14、 Gln 5´- AUG CCU UCA AGA UGU GGA CAA-3´多肽 Met Pro Ser Arg Cys Gly Gln 5´- AUG CCU UCA GGA UGU GGG CAA-3´多肽

15、 Met Pro Ser Gly Cys Gly Gln 5´ -AUG CCU UCA AGA UGA GGG CAA-3´多肽 Met Pro Ser Arg Stop Gly Gln 5´

16、-AUG CCU UCA AG UGU GGG CAA-3´ 5´-AUG CCU UCA AGU GUG GGC AA-3´多肽 Met Pro Ser Ser Val Gly etc,,同義突變,錯(cuò)義突變,,無義突變,移碼突變,2、表型變化

17、,,營(yíng)養(yǎng)缺陷型——一種缺乏合成其生存所必須的營(yíng)養(yǎng)物的突變型,必須從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營(yíng)養(yǎng)物 或其前體才能生長(zhǎng).抗性突變型——因突變而產(chǎn)生了對(duì)某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性的突變類型。條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長(zhǎng)繁殖，而在另一條件下卻無法生長(zhǎng)繁殖的突變型形態(tài)突變型——大小、形態(tài)、產(chǎn)孢能力、孢子多少和顏色、菌落特征等抗原突變型——因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變產(chǎn)量突變型——增加或減少毒力變異——毒力增

18、強(qiáng)、毒力減弱,二、基因突變的特點(diǎn),不對(duì)應(yīng)性：突變的性狀與突變?cè)蛑g無直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。獨(dú)立性：各種突變獨(dú)立發(fā)生，不會(huì)互相影響?？烧T發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。可逆性：,正向突變：從原始的野生型基因到變異株的突變回復(fù)突變：從突變株回到野生型的過程,突變率,突變率：每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率也可以用每

19、一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。突變率=突變細(xì)胞數(shù)/分裂前群體細(xì)胞數(shù),若干細(xì)菌某一性狀的自發(fā)突變率,菌 名 突變性狀突變率E. coli抗T1噬菌體3 ×10–8E. coli抗T3噬菌體1 ×10–7 E. coli不發(fā)酵乳糖1 ×10–10E. coli 抗紫外線1 ×10–5Staphylococcus aureus

20、 抗青霉素1 ×10–7S. aureus 抗鏈霉素1 ×10–9 Salmonella typhi抗25?g/L鏈霉素1 ×10–6 Bacillus megaterium 抗異煙肼5 ×10,微生物細(xì)胞在紫外線下照射，出現(xiàn)抗紫外線的菌株；敏感細(xì)菌與噬菌體混合培養(yǎng)，涂布平板，出現(xiàn)抗噬菌體的菌落；細(xì)菌細(xì)胞在含有某種藥物的環(huán)境下生長(zhǎng)，出現(xiàn)了抗藥性菌株,如何解釋這些現(xiàn)象

21、？,三、基因突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的證明,1. 變量試驗(yàn)2. 涂布試驗(yàn)3. 平板影印培養(yǎng)試驗(yàn),變量試驗(yàn)：（波動(dòng)試驗(yàn)或彷徨試驗(yàn)）,1943年，Luria 和M. Delbrück 根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，設(shè)計(jì)了的實(shí)驗(yàn)。,四、基因突變的分子基礎(chǔ),自發(fā)突變誘發(fā)突變,1、自發(fā)突變的分子機(jī)制,堿基的互變異構(gòu)DNA的復(fù)制錯(cuò)誤：包括脫嘌呤、脫嘧啶環(huán)出效應(yīng)微生物自身產(chǎn)生的誘變物質(zhì)：生物堿、重氮絲氨酸、轉(zhuǎn)座因子等環(huán)境對(duì)微生物的誘變作用

22、,,★環(huán)出效應(yīng)：,2、誘發(fā)突變的分子機(jī)制,誘變劑的種類物理誘變劑化學(xué)誘變劑生物誘變劑,1、化學(xué)誘變劑,直接引起突變的誘變劑：亞硝酸、羥胺和烷化劑等間接引起突變的誘變劑：堿基類似物移碼突變劑,直接引起突變的誘變劑：亞硝酸,5-Bu與T,堿基類似物,酮式,烯醇式（頻率高）,,,,酮式,酮式,2-NH2-A與A,常用的誘變劑--堿基類似物,移碼突變劑,這類化合物都是平面型的三環(huán)分子，它們的結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤—嘧啶對(duì)十分相似。溴化乙啶,移

23、碼突變劑,Ames test——檢測(cè)化學(xué)誘變劑,Ames test的基本依據(jù)是什么？,“生物化學(xué)統(tǒng)一性”法則：,人和細(xì)菌在DNA的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會(huì)作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良的后果,誘變劑與致癌物質(zhì)——Ames試驗(yàn),所有生物的DNA在結(jié)構(gòu)及特性上具有一致性,,讓細(xì)菌代人受過！,證明Ames試驗(yàn)重要性的應(yīng)用實(shí)例：,國外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)?！保捎谄?/p>

24、藥效顯著，在60-70年代十分流行，但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應(yīng)停”，后來采用Ames試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強(qiáng)的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進(jìn)行Ames試驗(yàn)檢測(cè)，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免。,物理誘變劑,非電離輻射誘變劑電離輻射誘變劑,非電離輻射-紫外線,1、紫外線的誘變機(jī)制DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)胞嘧啶與尿嘧啶的水合作用

25、DNA鏈的斷裂形成胸腺嘧啶二聚體,光復(fù)活作用,對(duì)照：8×106個(gè)/ml 100個(gè)/ml試驗(yàn)：8×106個(gè)/ml 2×106個(gè)/ml,,,U.V.,可見光，30分,U.V.,光復(fù)活作用：經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時(shí)，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象。E.coli的實(shí)驗(yàn)中：,由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用，所以進(jìn)行紫外線誘變育種時(shí)，只能在

26、紅光下照射及處理照射后的菌液。,生物誘變劑,噬菌體轉(zhuǎn)座因子基因誘變劑,突變與育種,自發(fā)突變與育種從生產(chǎn)中選育定向培育優(yōu)良菌株誘變育種,誘變育種的應(yīng)用,提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量改善菌種的特性開發(fā)新品種,提高產(chǎn)品的質(zhì)量如產(chǎn)品純度、有效組分的比例簡(jiǎn)化工藝，縮短生產(chǎn)周期,2U,600U,7000U,60000U,,是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株

27、的一種育種方法。,誘變育種具有極其重要的實(shí)踐意義。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。,誘變育種,誘變育種的基本步驟,出發(fā)菌株,,出發(fā)菌株的純化,單孢子或單細(xì)胞懸液的制備,,誘變處理,,,,突變株的分離和篩選,誘變育種中的幾個(gè)原則,選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株處理單孢子或單細(xì)胞懸液選用合適的誘變劑量充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)設(shè)計(jì)高效篩選方案,,選擇合

28、適的誘變劑,根據(jù)菌種的特性和遺傳穩(wěn)定性來選擇誘變劑遺傳性能穩(wěn)定的菌株——突變譜廣，誘變效率高、強(qiáng)誘變劑遺傳性能不穩(wěn)定的菌株——溫和誘變劑參考出發(fā)菌株原有的誘變譜系來確定誘變劑在選用理化因子作誘變劑時(shí)，在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。,出發(fā)菌株的選擇,出發(fā)菌株應(yīng)具備： ①具

29、有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力； ②每次誘變或均有一些表型改變的菌株 ③有其他一些優(yōu)良性狀： 出發(fā)菌株的來源： ①自然界直接分離到的野生型菌株 ②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株 ③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株,要求： ①菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞（單孢子）方法： ①玻璃珠打散10-15min; ②加０.3%吐溫80（表面活性劑） ③用

30、無菌脫脂棉過濾。 制備： 物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl) 化學(xué)誘變劑——緩沖液 濃度： 細(xì)菌、放線菌 108個(gè)/ml 霉菌、酵母菌 106個(gè)/ml,制備單細(xì)胞（單孢子）懸液,確定合適的誘變劑量,誘變劑劑量： 一般指強(qiáng)度與作用時(shí)間的乘積。各種誘變劑有不同的劑量表示方式，如化學(xué)誘變劑以一

31、定溫度下誘變劑的濃度和處理時(shí)間來表示。在育種實(shí)踐中，常以殺菌率來作誘變劑的相對(duì)劑量。誘變劑的合適劑量： 凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，能擴(kuò)大變異幅度，促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。,確定合適的誘變劑量,在一定的劑量范圍內(nèi)，突變率往往隨劑量的增高而提高，但正變較多出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變則較多出現(xiàn)在偏高的劑量中；。因此，在誘變育種工作中，目前大家比較傾向于采用較低的劑量（致死率在70~80%）劑量-存活率曲線,,土霉素

32、高產(chǎn)菌株紫外線照射劑量與變異的關(guān)系,5、誘變處理方式,單因子處理復(fù)合因子處理兩種因子同時(shí)處理不同誘變劑交替處理：先弱后強(qiáng)同一誘變劑連續(xù)重復(fù)使用紫外線-光復(fù)活交替處理,,復(fù)合因子處理效果優(yōu)于單因子處理,,~10-1,~10-2,~10-2,~10-2,突變株的分離和篩選,,初篩：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)；——因此，初篩工作以量為主，測(cè)定的精確性還在其次；初篩手段

33、應(yīng)盡可能快速、簡(jiǎn)單。復(fù)篩：確認(rèn)符合要求的菌株；——復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測(cè)定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。,根據(jù)菌落形態(tài)變異進(jìn)行平板菌落預(yù)篩,赤霉素生產(chǎn)菌：紅色色素由暗變紅，產(chǎn)量下降紅霉素生產(chǎn)菌：產(chǎn)生色素的-低產(chǎn)菌株不產(chǎn)孢子：淘汰高產(chǎn)菌株經(jīng)一次誘變形態(tài)發(fā)生巨大改變：淘汰,根據(jù)平板菌落的生化反應(yīng)進(jìn)行平板菌落預(yù)篩,透明圈法：胞外水解酶高產(chǎn)菌株淀粉酶：淀粉培養(yǎng)基，加I-KI顯色核酸酶：3%的酵母RNA,0.1EDTA，蛋白酶：酪蛋白培養(yǎng)基

34、產(chǎn)有機(jī)酸的微生物：碳酸鈣培養(yǎng)基,變色圈,果膠酶：0.2%為唯一碳源的培養(yǎng)基，培養(yǎng)后加指示劑0.2%剛果紅染色4h，紅色變色圈谷氨酸產(chǎn)生菌：溴百里酚藍(lán)：pH<6.2，黃色；pH》7.6，蘭色；脂肪酶：吐溫培養(yǎng)基，尼羅藍(lán)為指示劑大豆油培養(yǎng)基，維多利亞藍(lán)指示劑乙醇產(chǎn)生菌：含鹽的瓊脂（蘭色），淡白色的圈,生長(zhǎng)圈,分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素高產(chǎn)菌株配制基本培養(yǎng)基與相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株（指示菌）混勻涂布待檢菌懸液菌周圍形

35、成混濁的生長(zhǎng)圈,抑 菌 圈,誘變育種實(shí)例：營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的選育,作為菌株的遺傳標(biāo)記：進(jìn)行基因工程、誘變育種；研究代謝過程時(shí)用作親本標(biāo)記；作為aa、維生素、堿基的測(cè)定菌株；營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株可以大量積累某種目的產(chǎn)物，是最重要的氨基酸、核苷酸等生產(chǎn)菌種。,與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基（MM）[-]：凡是能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）[+]：滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的天然或

36、半合成培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）[x]：在MM中有針對(duì)性地加入一或幾種營(yíng)養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基。,營(yíng)養(yǎng)缺陷型選育的步驟及方法,營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定,誘變處理,營(yíng)養(yǎng)缺陷型的濃縮,營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出,,,,缺陷型的濃縮：,抗生素法方法：原理：,CM培養(yǎng)2-3代，離心洗滌,無N的MM培養(yǎng)4-6h,,,含青霉素的MM培養(yǎng),誘變后菌液,CM,適用于：絲狀微生物原理：,菌絲過濾法,缺陷型的濃縮：,方法：將菌在MM基培

37、養(yǎng)一段時(shí)間后加熱到80度左右，維持一定時(shí)間適用于：原理：,高溫殺菌法,缺陷型的濃縮：,①逐個(gè)檢出法：,缺陷型的檢出：,影印平板培養(yǎng)法,,注意：防止菌落擴(kuò)散改進(jìn)方法：適應(yīng)范圍：,夾層培養(yǎng)法（延遲補(bǔ)給法）,缺陷型的濃縮：,營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定,生長(zhǎng)譜法,第三節(jié) 微生物基因重組與雜交育種,基因重組：把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱為基因重組（gene recombination

38、）或遺傳重組。作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個(gè)體。,基因重組的實(shí)踐意義,擴(kuò)大變異的范圍，獲得性狀更為優(yōu)良的菌株可以消除某一菌株在經(jīng)過長(zhǎng)期誘變處理后所出現(xiàn)產(chǎn)量上升緩慢、孢子減少等其他負(fù)變性狀。由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，因此，不論在方向性還是自覺性方面，均比誘變育種前進(jìn)了一大步。,甲生長(zhǎng)快、產(chǎn)量低,乙生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量高,,基因重組,如：,生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高,,細(xì)胞融合或聯(lián)結(jié),,性細(xì)胞

39、融合或聯(lián)結(jié)：有性生殖（真菌）體細(xì)胞融合或聯(lián)結(jié)：準(zhǔn)性生殖（真菌）,細(xì)胞間暫時(shí)溝通：細(xì)菌的接合,細(xì)胞間不接觸,,受體細(xì)胞直接吸收游離DNA片段：細(xì)菌的轉(zhuǎn)化噬菌體介導(dǎo)：細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo),由噬菌體提供遺傳物質(zhì)：轉(zhuǎn)染和溶源轉(zhuǎn)變,微生物基因重組的幾種方式,細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移和重組,接合（conjugation）轉(zhuǎn)化（transformation）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）,一、轉(zhuǎn)化（transformation）,轉(zhuǎn)化：受體菌直接吸收來自供

40、體菌的DNA片段而獲得部分新的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化。,受體菌,供體菌,轉(zhuǎn)化因子,重組子或轉(zhuǎn)化子,,1、兩菌株的親緣關(guān)系應(yīng)接近兩個(gè)菌種或菌株之間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化，與它們?cè)谶M(jìn)化過程中的親緣關(guān)系有著密切的關(guān)系。但即使在轉(zhuǎn)化率極高的菌種中，其不同菌株間也不一定都能發(fā)生轉(zhuǎn)化。,（一）、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件,2、受體細(xì)胞要處于感受態(tài).感受態(tài)：competence，受體細(xì)胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)感受態(tài)出現(xiàn)：感

41、受態(tài)出菌種遺傳特性、培養(yǎng)時(shí)間（菌齡）、外界條件如Ca2+,cAMP),（一）轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件,DNA結(jié)合蛋白,小分子蛋白質(zhì)（感受態(tài)因子），與細(xì)胞表面受體M相互作用，誘導(dǎo)感受態(tài)特異蛋白質(zhì)表達(dá)，如自溶素，使細(xì)胞表面的DNA結(jié)合蛋白和核酸酶裸露出來。,,3、轉(zhuǎn)化因子：一般的轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈DNA；也有少數(shù)報(bào)道認(rèn)為線狀單鏈DNA也有轉(zhuǎn)化作用。大?。好恳晦D(zhuǎn)化DNA片段的分子量都小于1×107，即約占細(xì)菌核染色體組的0.3%，其上平

42、均約含15個(gè)基因。濃度： 大于1×10-5 ug/ml,（一）、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件,（二）、吸收數(shù)量與轉(zhuǎn)化頻率,吸收數(shù)量：每個(gè)感受態(tài)細(xì)胞約可摻入10個(gè)轉(zhuǎn)化因子。轉(zhuǎn)化頻率：一般只有0.1~1%，最高時(shí)亦達(dá)20%左右。據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式（雙鏈閉合環(huán)狀）的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高（因?yàn)樗M(jìn)入受體菌中后，可不必與受體染色體進(jìn)行交換、整合即可進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)）,（三）轉(zhuǎn)化的基本過程,1、感受態(tài)細(xì)胞的建立2、DNA的結(jié)合和攝取3、轉(zhuǎn)化因

43、子與染色體的重組,,,,（四）轉(zhuǎn)化的類型：,根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為：①自然遺傳轉(zhuǎn)化 -目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力②人工轉(zhuǎn)化,人工轉(zhuǎn)化——基因工程的基礎(chǔ),人工轉(zhuǎn)化——是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNA的能力，或人工地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。方法：①CaCl2處理細(xì)胞，使其成為能攝取外源DNA的感受態(tài)狀態(tài).②電穿孔法electroporation：用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜，或擊成小孔，使各種大分

44、子（包括DNA ）能通過這些小孔進(jìn)入細(xì)胞。,轉(zhuǎn)染（transfection）,定義：把噬菌體或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出來，讓它去感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并進(jìn)而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒的后代，這種現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)染（transfection）。與轉(zhuǎn)化的區(qū)別：病毒或噬菌體并非遺傳基因的供體菌中間不發(fā)生任何遺傳因子的交換或整合最后不產(chǎn)生具有雜種性質(zhì)的轉(zhuǎn)化子,二、接合（conjugation）,定義：指通過供體菌和受體菌的細(xì)胞直接接觸

45、而產(chǎn)生的遺傳信息轉(zhuǎn)移和重組的過程。 通過接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞就是接合子,,,1946年用E.coli的兩個(gè)多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型所作的實(shí)驗(yàn)：,,,1、接合及其發(fā)現(xiàn),A,B,U型管實(shí)驗(yàn)：,根據(jù)F因子在E. coli中的有無，及與染色體的關(guān)系，可將E. coli分為四種類型：,① F– （“雌性”）菌株：細(xì)胞中不含有F因子，細(xì)胞表面不具有有性纖毛。據(jù)估計(jì)，從自然界分離到的2000株E. coli中約有30%是F–菌株。,,,② F+（

46、“雄性”）菌株：細(xì)胞內(nèi)含有（1~4個(gè)）游離的F因子，細(xì)胞表面存在與F因子數(shù)目相當(dāng)?shù)男跃?③Hfr（高頻重組，high frequency recombination）菌株：含有與染色體特定位點(diǎn)整合的F因子。因該菌株與F– 接合后的重組頻率比F+ 菌株高幾百倍而得名。,④F’菌株：細(xì)胞中含有游離的、帶小段染色體基因的環(huán)狀F因子，可與F– 菌株接合，使其成為F′菌株。,F′菌株的形成：由Hfr菌株中的F因子在不正常切離而脫離核

47、染色體組時(shí)所形成，并因此造成細(xì)胞染色體發(fā)生缺失， F因子也缺失一段DNA.,,2．幾種接合的結(jié)果,（1）F+×F-雜交,結(jié)果： F+＋ F+,（2）Hfr×F- 接合,Hfr,F’×F-雜交會(huì)出現(xiàn)什么結(jié)果？,1、 轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)現(xiàn),1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder為了證實(shí)大腸桿菌以外的其它菌種是否也存在接合作用，用二株具不同的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)：,

48、用“U”型管進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)時(shí)，在給體和受體細(xì)胞不接觸的情況下，同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌！,三、轉(zhuǎn)導(dǎo),遺傳物質(zhì)通過噬菌體的攜帶而轉(zhuǎn)移的基因重組稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。,鼠傷寒沙門氏菌LT22A(p22),2、轉(zhuǎn)導(dǎo)的類型,,完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo)

49、 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限轉(zhuǎn)導(dǎo) 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo),,,,普遍轉(zhuǎn)導(dǎo),通過缺陷噬菌體對(duì)供體菌任何DNA小片段的“誤包”而實(shí)現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程,,供體菌,受體菌,一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成,第一次交換第二次交換交換完成，

50、外源DNA摻入染色體組中,流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo),受體菌經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的供體DNA片段在受體菌中不發(fā)生配對(duì)、交換和整合，也不迅速消失，而只是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯（性狀表達(dá)），這種現(xiàn)象就稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。,2. 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。特點(diǎn)：噬菌體對(duì)供體菌和受體菌都是溫和噬菌體只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個(gè)別特定基因（一般為噬菌體整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因）該特定基因由部分缺陷的噬菌體攜帶,,局

51、限轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程,1、溫和噬菌體的不正常切離,2、部分缺陷的溫和噬菌體感染受體菌,低頻轉(zhuǎn)導(dǎo),一般的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象中，從宿主染色體上切離時(shí)發(fā)生不正常切離的頻率極低，故這種裂解物中的部分缺陷噬菌體的比例是極低的（10 – 4 ~ 10 – 6）。把這種裂解物稱為L(zhǎng)FT（低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)）裂解物 。 LFT裂解物以低 m. o. i（感染復(fù)數(shù)）感染宿主，就可獲得極少量的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子，即低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。,E.coliK12Sgal-/ ? dgal+/ ?（雙重溶源菌

52、）?(50%) + ?dgal+（50%） E.coliK12Sgal-(受體菌),,,高頻轉(zhuǎn)導(dǎo),高頻轉(zhuǎn)導(dǎo),U.V.,,,,E.coliK12Sgal-/ ?dgal+ 轉(zhuǎn)導(dǎo)子,,噬菌斑,溶源轉(zhuǎn)變,概念：當(dāng)溫和噬菌體感染宿主而使其發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體的基因整合到宿主的核基因組上，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。性質(zhì)：表面上與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似，而本質(zhì)上不同于轉(zhuǎn)導(dǎo)。區(qū)別

53、：溫和噬菌體不攜帶來自供體菌的外源基因，是噬菌體自身基因使宿主獲得新性狀溫和噬菌體使完整的，不是缺陷的獲得新性狀的是溶源化的宿主細(xì)胞，不是轉(zhuǎn)導(dǎo)子當(dāng)宿主喪失其原噬菌體時(shí)，通過溶源轉(zhuǎn)變而獲得的新性狀也隨之消失,,典型實(shí)例,Corynebacterium diphtheriae（白喉棒桿菌）：白喉毒素/?溫和噬菌體Clostridium botulinum（肉毒梭菌）：C型或D型肉毒毒素Salmonella anatum（鴨沙門氏

54、菌）：細(xì)胞表面多糖/E15噬菌體Streptomyces erythreus（紅霉素鏈霉菌）：合霉素合成和氣生菌絲形成/P4溫和噬菌體,原生質(zhì)體融合,原生質(zhì)體融合：去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，用物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)，通過細(xì)胞質(zhì)融合，基因組接觸、交換，從而發(fā)生基因組的遺傳重組。,可以沖破種、屬的界線，廣泛地在有生產(chǎn)價(jià)值的微生物種間以至屬間進(jìn)行雜交育種；原生質(zhì)體融合后，兩個(gè)親株的整套基因組相互接觸，可以有機(jī)會(huì)發(fā)生多次交換，產(chǎn)生各

55、種各樣的基因組合而得到多種類型的重組子重組頻率高融合工作要求設(shè)備條件不高，一般實(shí)驗(yàn)室都可以進(jìn)行。,原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)點(diǎn),原生質(zhì)體融合實(shí)例,以酒精酵母和熱帶假絲酵母為親本,獲得了既具有糖化酶活性又能高產(chǎn)酒精穩(wěn)定的酵母融合株,具有良好的應(yīng)用前景。利用發(fā)酵力強(qiáng)的葡萄酒酵母與降酸能力強(qiáng),發(fā)酵性能好的杰酒裂母融合, 獲得的融合子降酸率可達(dá)30 4%,比葡萄酒酵母的降酸性提高20%。將能夠分解纖維素的木霉和從葡萄糖產(chǎn)酒精的釀酒酵母進(jìn)行融合

56、,得到具有很強(qiáng)的將濾紙纖維素轉(zhuǎn)化為酒精的融合子。酒精酵母(Ｋ酵母)和產(chǎn)酯酵母(Ｆ2)進(jìn)行了屬間細(xì)胞融合,獲得既具有高產(chǎn)酒特性,又具有高產(chǎn)酯特性的發(fā)酵性能穩(wěn)定的融合子。,,,原生質(zhì)體融合的主要步驟：,選擇親株→ →制備原生質(zhì)體→→原生質(zhì)體融合 → →原生質(zhì)體 再生→ → 篩選優(yōu)良性狀的融合重組子,衰退（degeneration） ：菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等

57、現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。衰退的原因：①基因突變，②分離現(xiàn)象。常見的衰退現(xiàn)象：菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變； 生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少； 抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降；,第四節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,①控制傳代次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過程中，堿基的錯(cuò)配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9）； ②選擇合適的培養(yǎng)條件； ③采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代（對(duì)絲狀微生物而言

58、，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種）； ④采用有效的菌種保藏方法。,防止菌種衰退的方法：,菌種的復(fù)壯：使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀。狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測(cè)定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識(shí)的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測(cè)定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選

59、種。,菌種的復(fù)壯（rejuvenation）,菌種的復(fù)壯措施：,純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）通過寄主體內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillus thuringiensis的復(fù)壯）淘汰已衰退的個(gè)體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）采用有效的菌種保藏方法,微生物菌種的保藏,目的：保持菌種優(yōu)良的生產(chǎn)性能和生活能力，盡量減少、推遲負(fù)變，防止死亡，并確保不被污染，隨時(shí)為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良

60、菌種原理：選用優(yōu)良的純種，（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等），創(chuàng)造降低微生物代謝活動(dòng)強(qiáng)度，生長(zhǎng)繁殖受抑制，難以發(fā)生突變的環(huán)境條件（干燥、低溫、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng) 以及添加保護(hù)劑等），使之能長(zhǎng)時(shí)間地保存。,菌種保藏的常用方法,低溫保藏法方法：菌種管置4℃冰箱保藏（保存時(shí)間3-6個(gè)月） ，定時(shí)傳代 原理：低溫下，微生物代謝強(qiáng)度明顯下降 。石蠟油低溫保藏法： （保存時(shí)間1-2年） 橡皮塞取代棉塞、加石蠟油。,液氮超低溫保藏法,將菌種置

61、于保護(hù)劑中，預(yù)凍后保存在液氮超低溫冰箱中（ -196℃）。適用于各種微生物的較理想的保藏方法。 （保存時(shí)間5-10年）保護(hù)劑：甘油（10-20%）、二甲基亞砜（5-10%） 、血清蛋白、吐溫80、聚二烯氮戊環(huán)（0.4mmol/L),加有保護(hù)劑的菌懸液在凍結(jié)狀態(tài)下予以真空干燥,然后真空狀態(tài)下密封瓶口隔絕氧氣，置于低溫下保藏。適用于各種微生物，便于大量保藏，菌種存活時(shí)間長(zhǎng)（保存時(shí)間5-10年） ，是目前最好的保藏方法。,真空冷凍干燥法

62、,干燥保藏法,沙土管保藏法沙土制備：選取黃沙土——10%鹽酸浸泡4h，沖洗至中性——烘干——過篩（60目）——除掉鐵質(zhì)地表土壤—10%鹽酸浸泡4h，沖洗至中性——烘干——過篩（120目）——除掉鐵質(zhì)黃沙土與地表土壤按1：1或3：2混合，裝入試管（1.5~2.0g)加塞，滅菌——烘干菌種制備：生長(zhǎng)健壯、孢子豐滿埋沙土適量的無菌水洗下孢子-孢子懸液（108個(gè)/ml).取0.2`0.3ml加入到沙土中混勻，抽真空（4h）低溫干燥