第六章微生物的遺傳和變異

1、第六章微生物的遺傳和變異,,主要內(nèi)容：,核酸的基本化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)微生物的遺傳微生物的變異基因重組遺傳工程技術(shù),●1868年，F(xiàn). Miescher從細(xì)胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)。,,第一節(jié) 核酸的基本化學(xué)組成與結(jié)構(gòu),,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,堿基,戊糖,,元素組成： C H O N P,核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖（核糖或脫氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和

2、核苷酸。每個(gè)核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。,,組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為 β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。,一、戊糖,二、堿基,1. 嘌呤（Purine）,2. 嘧啶（Pyrimidine）,,核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。,,三、核苷（n

3、ucleoside）,核苷 戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵,假尿苷（ψ）次黃苷（肌苷）I黃嘌呤核苷 X二氫尿嘧啶核苷 D取代核苷的表示方式7-甲基鳥苷 m5G,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸,五、核苷

4、酸衍生物,1. 繼續(xù)磷酸化,2.環(huán)化磷酸化,cAMP,cGMP,3. 肌苷酸及鳥苷酸(強(qiáng)力味精),4. 輔酶 NAD、NADP、FMN,,IMP GMP,六、多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通過(guò)一個(gè)核苷酸的C3’-OH 與另一分子核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。,5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3

5、′-羥基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個(gè)多聚核苷酸鏈時(shí)，必須注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,5′PdAPdCPdGPdTOH 3′ 5′PAPCPGPUOH ′ 或5′ACGTGCGT 3′

6、 5′ACGUAUGU 3′ ACGTGCGT ACGUAUGU,98％核中（染色體中） 真核 線粒體（mDNA） 核外 葉綠體（ctDNA）DNA 擬核

7、 原核 核外：質(zhì)粒（plasmid） 病毒：DNA病毒,核酸分為兩大類： 脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA）,RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,轉(zhuǎn)運(yùn)RNA ( tRNA) t-RNA約占細(xì)胞總RNA的10～15％，也稱之為“受體RNA”。核糖體RNA （ rRNA） r-R

8、NA約占細(xì)胞總RNA的80％，是核糖體的核酸。 信使RNA （mRNA） m-RNA約占細(xì)胞總RNA的5％左右，為單鏈結(jié)構(gòu)，不同細(xì)胞的m-RNA的鏈長(zhǎng)和分子量的差異很大。,第二節(jié) 微生物的遺傳,遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)——DNA,▲40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA 1928年Griffith經(jīng)典的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)； 1941年Avery的轉(zhuǎn)化補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)； 1952年Hersey何Chase大腸桿菌T2噬菌體感染大腸桿菌試驗(yàn)；

9、 證明DNA是生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。,,,,,■ DNA的結(jié)構(gòu)與復(fù)制,50年代弄清了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),1953年Watson和Crick建立了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型—1957年諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)。,▲ DNA的結(jié)構(gòu),（Francis Crick,1916-2004)（右）和沃森(James Watson,1928-),DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),,,■DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),DNA分子由兩條DNA單鏈組成。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是分子中兩條DNA單鏈之

10、間基團(tuán)相互識(shí)別和作用的結(jié)果。雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的最基本形式。,三股螺旋結(jié)構(gòu)的DNA,DNA的存在形式,基因——遺傳因子 基因：是一切生物體內(nèi)儲(chǔ)存遺傳信息的、有自我復(fù)制能力的遺傳功能單位。它是DNA分子上一個(gè)具有特定堿基順序、即核苷酸序列的片斷。 基因按功能分三種： ①結(jié)構(gòu)基因 ②操縱基因 ③調(diào)節(jié)基因,,60年該確定了遺傳信息的傳遞方式,1961年J.Monod和F.Jacob提出了操縱子學(xué)說(shuō)；,■遺傳信

11、息的傳遞,1966年Nireberg破譯了遺傳密碼，敘述了中心法則；,,,基因工程的誕生理論上的三大發(fā)現(xiàn),▲DNA的復(fù)制,■DNA的變性和復(fù)性DNA變性,,,■DNA復(fù)性,變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過(guò)程的條件有關(guān)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但

12、是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性。分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。此外，DNA的復(fù)性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。,■DNA復(fù)性,,,■ RNA RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),tRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)tRNA分子具有以下特點(diǎn)：分子量25000左右，大約由70－90個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左右。分子中含有較多的修飾成分。3'-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)。,mRNA一級(jí)結(jié)構(gòu),真核細(xì)胞mRNA的3‘-末端有一段長(zhǎng)達(dá)200

13、個(gè)核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為 “尾結(jié)構(gòu)” ，5’ -末端有一個(gè)甲基化的鳥苷酸，稱為” 帽結(jié)構(gòu)“ 。,rRNA,動(dòng)物細(xì)胞核糖體rRNA有四類：5SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA，28SRNA。許多rRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)及由一級(jí)結(jié)構(gòu)推導(dǎo) 出來(lái)的二級(jí)結(jié)構(gòu)都已闡明，但是對(duì)許多rRNA的功能迄今仍不十分清楚。,tRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu),1，tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)都呈” 三葉草” 形狀，在結(jié)構(gòu)上具有某些共同之處，

14、一般可將其分為五臂四環(huán)：包括氨基酸接受區(qū)、反密碼區(qū)、二氫尿嘧啶區(qū)、T?C區(qū)和可變區(qū)。除了氨基酸接受區(qū)外，其余每個(gè)區(qū)均含有一個(gè)突環(huán)和一個(gè)臂。,2,tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu),在三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未配對(duì)的堿基由于整個(gè)分子的扭曲而配成對(duì)，目前已知的tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)均為倒L型,轉(zhuǎn)錄,,微生物生長(zhǎng)與蛋白質(zhì)合成,RNA與生物遺傳信息的表達(dá)-蛋白質(zhì)合成,首先，DNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄作用，將其所攜帶的遺傳信息（基因）傳遞給 mRNA, 在三種 RNA（

15、mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白質(zhì)的合成。,轉(zhuǎn)錄過(guò)程,翻譯過(guò)程,現(xiàn)在已經(jīng)知道作為多肽合成起始信號(hào)的密碼子有兩個(gè)，即甲硫氨酸的密碼子(AUG)和氨酸的密碼子(GUG)(極少出現(xiàn))。在大腸桿菌中, 起始密碼子AUG 所編碼的氨基酸并不是甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸。,,,第三節(jié) 微生物的變異,變異的實(shí)質(zhì)——基因突變,基因突變,上述DNA堿基順序的改變，是DNA在復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)誤產(chǎn)生的。由于DNA是具有復(fù)制功能的分子

16、，一旦DNA堿基順序出錯(cuò)，它就會(huì)通過(guò)復(fù)制機(jī)制遺傳下去。由于DNA堿基順序的改變引起生物遺傳性狀顯著變化的現(xiàn)象，稱為基因“突變”。,■突變的類型,自發(fā)突變 ▲多因素低劑量的誘變效應(yīng) ▲互變異構(gòu)效應(yīng)誘發(fā)突變 ▲物理誘變 ▲化學(xué)誘變 ▲復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng) ▲定向培育和馴化,(1) DNA分子中堿基互變異構(gòu),DNA分子的堿基，存在酮式—烯醇式或氨式—亞胺式互變異構(gòu)。不同的互變異構(gòu)體形成氫鍵的方向和能力不同，有可能導(dǎo)致復(fù)制時(shí)

17、出現(xiàn)錯(cuò)誤。例如在正常情況下，A（氨式結(jié)構(gòu)）與T（酮式結(jié)構(gòu)）配對(duì)；當(dāng)A以亞胺式存在時(shí)（幾率非常小），則與C配對(duì)。,(2) 物理因素,能夠引起基因突變的物理因素主要包括：紫外線（UV）、高能射線和電離輻射等。,當(dāng)DNA受到大劑量紫外線（波長(zhǎng)260nm附近）照射時(shí)，可引起DNA鏈上相鄰的兩個(gè)嘧啶堿基共價(jià)聚合，形成二聚體，例如TT二聚體。,,光聚合反應(yīng),胸腺嘧啶堿基在紫外光照射下，可以發(fā)生二聚加成反應(yīng)：

18、 在DNA分子中，如果兩個(gè)胸腺嘧啶堿基相鄰，在紫外光照射下，可能發(fā)生上述聚合反應(yīng)，其結(jié)果是破壞了正常復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。,X-射線以及放射性物質(zhì)產(chǎn)生的輻射具有很高的能量，能直接引起DNA物理或化學(xué)性質(zhì)的改變。另外，電離輻射將也能使DNA周圍環(huán)繞的其它分子（主要是水）產(chǎn)生具有很高活性的自由基，這些自由基能夠進(jìn)一步與DNA分子反應(yīng)，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。,(3) 化學(xué)因素,化學(xué)因素是引起DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的最常見因素，主要包括：烷

19、基化試劑，亞硝酸鹽以及堿基類似物等。烷基化試劑能夠與DNA分子中的氨基或氧作用，生成烷基化DNA。除了堿基上有多個(gè)位置可被烷基化外，DNA鏈上磷酸二酯鍵中的氧也容易被烷基化，從而導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。,烷基化反應(yīng),由于含氧堿基存在酮式和烯醇式的互變異構(gòu)，烯醇式中的羥基可以被烷基化轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的烯醇醚。鳥嘌呤核苷烷基化形成6-甲氧基鳥嘌呤核苷后，不再與C配對(duì)，而與T配對(duì)。這種情況將引起DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及信息表達(dá)出現(xiàn)錯(cuò)誤。,環(huán)外氨基的反

20、應(yīng),環(huán)外氨基在適當(dāng)條件下，也可以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。胞嘧啶核苷在亞硝酸作用下，可以形成重氮鹽，再轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ず塑?。因此生物體內(nèi)亞硝酸的存在有可能改變DNA的堿基組成。腺嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷也能發(fā)生類似的反應(yīng)，分別形成次黃嘌呤核苷（I）和黃嘌呤核苷（X）。這種變化，將影響或改變堿基形成氫鍵的能力和方向，導(dǎo)致DNA復(fù)制錯(cuò)誤，是引起基因突變的重要原因之一。,堿基類似物是一類結(jié)構(gòu)與核酸堿基相似的人工合成或天然化合物，由于它們的結(jié)構(gòu)與核酸的

21、堿基相似，當(dāng)這些物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞后能夠摻入到DNA鏈中，干擾DNA的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。常見的有堿基衍生物及稠環(huán)、稠雜環(huán)類化合物。例如5-溴尿嘧啶（5-BU），它與胸腺嘧啶堿基的結(jié)構(gòu)相似，能取代T與A配對(duì)。又如一種稱為二惡英的含氯芳香雜三環(huán)化合物（2,3,7,8-四氯-二苯-二惡英，簡(jiǎn)稱TCDD），是一種具有強(qiáng)烈致癌和致畸物質(zhì)。它能夠進(jìn)入細(xì)胞并與DNA結(jié)合，導(dǎo)致DNA復(fù)制發(fā)生錯(cuò)誤，從而可能誘發(fā)癌變。,2. DNA損傷修復(fù),光復(fù)活切除修復(fù)

22、重組修復(fù)SOS修復(fù),光復(fù)活（photoreactivation）,可見光（最有效波長(zhǎng)400nm）激活生物界廣泛分布（高等哺乳動(dòng)物除外）的光復(fù)活酶，該酶分解嘧啶二聚體。是一種高度專一的修復(fù)形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚體。,切除修復(fù)（excision repair）,即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷的部分切除掉，并以完整的那一段為模板，合成出切去的部分，從而使DNA恢復(fù)正常。這是一種比較普遍的修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞的修復(fù)

23、功能對(duì)于保護(hù)遺傳物質(zhì)DNA不受破壞有重要意義。,重組修復(fù)（recombination repair）,又稱復(fù)制后修復(fù)（postreplication repair）受損傷的DNA在進(jìn)行復(fù)制時(shí)，跳過(guò)損傷部位，在子代DNA鏈與損傷相對(duì)應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。通過(guò)分子間重組，從完整的母鏈上將相應(yīng)的堿基順序片段移至子鏈的缺口處，然后再用合成的多核苷酸來(lái)補(bǔ)上母鏈的空缺，此過(guò)程即重復(fù)修復(fù)。并非完全校正。,SOS修復(fù),指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)

24、時(shí)所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯(cuò)誤較多，又稱傾錯(cuò)性修復(fù)（Error-Prone Repair ）。,第三節(jié) 基因重組,雜交： 是通過(guò)雙親細(xì)胞的融合，使整套染色體的基因重組，或者是通過(guò)雙親細(xì)胞的溝通，使部分染色體基因重組。轉(zhuǎn)化： 受體細(xì)胞直接吸收來(lái)自供體細(xì)胞得DNA片斷，并把它整合到自己的基因組里，從而獲得了供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。,,通過(guò)溫和噬菌體的媒介作用，

25、把供體細(xì)胞內(nèi)特定的基因（DNA片斷）攜帶至受體細(xì)胞中，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。,轉(zhuǎn)導(dǎo),第四節(jié) 遺傳工程技術(shù)在環(huán)境工程中的應(yīng)用,遺傳工程技術(shù)在環(huán)境工程中的應(yīng)用,■質(zhì)粒育種: 將兩種或多種微生物通過(guò)細(xì)胞結(jié)合或融合技術(shù)，使供體菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到受體內(nèi)，使受體菌保留自身功能質(zhì)粒，同時(shí)獲得供體菌的功能質(zhì)粒，即培育出具有兩種功能質(zhì)粒的新品種。 ▲多功能超級(jí)細(xì)菌的構(gòu)建； ▲工程菌的構(gòu)建；,,,改變細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶或酶系統(tǒng)：隨著工業(yè)

26、發(fā)展，大量的合成有機(jī)化合物進(jìn)入環(huán)境，其中很大部分難于生物降解或降解緩慢，只是在環(huán)境中的停留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)年至數(shù)十年?；蚬こ虨樵摳淖兗?xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶或酶系統(tǒng)提供了可能，從而可以：提高微生物的降解速率；拓寬底物的專一性范圍；維持低濃度下的代謝活性；改善有機(jī)污染物降解過(guò)程中的生物催化穩(wěn)定性；,,設(shè)計(jì)復(fù)合代謝途徑； 2，4，6-三硝基甲苯（TNT）； 假單胞菌可以利用TNT為唯一碳源，但不能利用甲苯； 將具有甲苯完整降

27、解途徑的TOL質(zhì)粒pWO-Km導(dǎo)入該微生物，可以擴(kuò)展微生物的代謝能力，構(gòu)建的新微生物可以是TNT完全降解。,,拓寬氧化酶的專一性； 三氯乙烯(TCE)某些氧化酶可以進(jìn)攻該分子，但氧化速率低；甲苯雙氧化酶對(duì)TCE具有部分活性，但催化過(guò)程中易失活；而聯(lián)苯雙氧化酶不能氧化，而基因工程構(gòu)建的雜和聯(lián)苯雙氧化酶體系可以氧化TCE，且其氧化速度為天然甲苯雙合氧化酶的3倍；且穩(wěn)定性更好，在環(huán)境污染物降解方面有大作為。,,增強(qiáng)無(wú)機(jī)磷的去除：

28、活性污泥只能去除城市廢水中20%-40%無(wú)機(jī)磷， 有些細(xì)菌能夠以聚磷酸鹽形式過(guò)量積累磷，通過(guò)對(duì)E.coli polyP激酶基因ppK和再生ATP乙酸激酶基因ackA進(jìn)行擴(kuò)增，可以有效的提高E.coli對(duì)無(wú)機(jī)磷的去除能力2-3倍，4h將0.5mol/L的磷酸鹽去除約90%。 此結(jié)果顯示，通過(guò)基因工程改進(jìn)酶的活性，在無(wú)機(jī)污染物如磷的處理方面也大有潛力。,■基因工程技術(shù),技術(shù)上的三大發(fā)明：●工具酶 1970年Smith和Wi

29、lcox從流感嗜血桿菌中分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindⅡ，使DNA分子的切割成為可能。 1967年世界上5個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，使DNA裂口的修復(fù)成為可能。,,● 載體 大多數(shù)DNA片斷不具備自我復(fù)制的能力，為了使它們能夠在宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，必須將DNA片斷接到一種特定的，具有自我復(fù)制能力的DNA分子上，這種DNA分子就是基因工程載體（vector）。 可作為基因載體的有： 病毒；噬菌體；質(zhì)粒等不同

30、小分子量的復(fù)制子。 最常用的是抗藥性R因子質(zhì)粒分子pBR322和pUC13。,●逆轉(zhuǎn)錄酶 1970年Baltimore等人同時(shí)發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。 具備了以上的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，基因工程誕生的條件已經(jīng)成熟。 1972年斯坦福大學(xué)的P.Berg等人在世界上第一次實(shí)現(xiàn)了DNA體外重組。 猿猴病毒SV40DNA+λ噬菌體DNA---→重組DNA分子； 1973年斯坦福大學(xué)地S.Coh

31、en成功地進(jìn)行了另一個(gè)體外重組DNA實(shí)驗(yàn)并成功地實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。 大腸桿菌抗四環(huán)素質(zhì)粒pSC101+抗新霉素質(zhì)粒R6-3 ---→重組DNA分子----→大腸桿菌（篩選出了抗四環(huán)素和抗新霉素的重組菌落 基因工程從此誕生了。,●基因工程的內(nèi)容,帶有目的基因的DNA片斷的獲??；在體外將目的基因片斷連接到載體分子上，形成重組分子；重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；帶有重組DNA分子的細(xì)胞擴(kuò)增，獲得大量的細(xì)胞繁殖群體;重組體的篩選；