☆如何閱讀質(zhì)粒圖譜

1、如何閱讀質(zhì)粒圖譜更新2011525117如何閱讀質(zhì)粒圖譜如何閱讀質(zhì)粒圖譜最近由于實(shí)驗(yàn)需要需要查閱載體圖譜到園子里搜羅一番發(fā)現(xiàn)雖然有人問(wèn)載體圖譜閱讀的問(wèn)題也有前輩回答但都不詳細(xì)借自己也在琢磨這個(gè)問(wèn)題的機(jī)會(huì)將我學(xué)到的東西整理一下于大家分享。載體主要有病毒病毒和非病毒非病毒兩大類其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。一、一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素一、一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素#復(fù)制起始位點(diǎn)il即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制

2、起始點(diǎn)。而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。?？股乜剐曰蚩梢员阌诩右詸z測(cè)，如AmplKan＃多克隆位點(diǎn)MCS克隆攜帶外源基因片段l＃PE啟動(dòng)子增強(qiáng)子l＃Termsl終止信號(hào)＃加poly（A）信號(hào)l可以起到穩(wěn)定mRNA作用二、如何閱讀質(zhì)粒圖譜二、如何閱讀質(zhì)粒圖譜第一步：首先看首先看i的位置的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核原核真核真核穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒）第二步：再看篩選標(biāo)記再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。（1）Ampr水解β－

3、內(nèi)酰胺環(huán)－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。（2）tetr可以阻止四環(huán)素四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。（3）camr生成氯霉素羥乙?；苌锫让顾亓u乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）ne（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活（卡那霉素衍生物）失活（5）hygr使潮霉素潮霉素β失活。第三步：看多克隆位點(diǎn)（看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種

4、標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源再看外源DNA插入片段大小插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源的外源DNA片段片段。一般來(lái)說(shuō)，外源DNA片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這是用來(lái)區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺?/p>

5、載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)＃啟動(dòng)子－促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，這個(gè)DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。＃增強(qiáng)子沉默子－為真核基因組（包括真

6、核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無(wú)關(guān)其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無(wú)關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。沉默子－負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。＃核糖體結(jié)合位點(diǎn)起始密碼SD序列（RbsAGUSDs）：mRNA有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列。l＃轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down

7、－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號(hào)。如何閱讀質(zhì)粒圖譜更新2011525317不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。選用質(zhì)粒（最常用）做載體的4點(diǎn)要求：①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒10個(gè)。③必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；④必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性

8、基因，不特指多位Ampr（試一試）。無(wú)論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進(jìn)行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plas）是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。其特點(diǎn)如下：①是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA（covalentlyclosedcircuarDNAcccDNA），可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2300kb之間，＜15kb的小質(zhì)粒

9、比較容易分離純化，＞15kb的大質(zhì)粒則不易提取。②能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子（autonomousreplicon）。一般質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)?？呻S宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。按質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：嚴(yán)緊控制（stringentcontrol）型質(zhì)粒的復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)到十幾個(gè)拷貝；另一類是松弛控制（relaxedcontrol）型質(zhì)粒，其復(fù)制宿主不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。每個(gè)

10、質(zhì)粒DNA上都有復(fù)制的起點(diǎn)，只有i能被宿主細(xì)胞復(fù)制蛋白質(zhì)識(shí)別的質(zhì)粒才能在該種細(xì)胞中復(fù)制，不同質(zhì)粒復(fù)制控制狀況主要與復(fù)制起點(diǎn)的序列結(jié)構(gòu)相關(guān)。有的質(zhì)粒的可以整合到宿主細(xì)胞染色質(zhì)DNA中，隨宿主DNA復(fù)制，稱為附加體，例如細(xì)菌的性質(zhì)粒就是一種附加體，它可以質(zhì)粒形式存在，也能整合入細(xì)菌的DNA，又能從細(xì)菌染色質(zhì)DNA上切下來(lái)。F因子攜帶基因編碼的蛋白質(zhì)能使兩個(gè)細(xì)菌間形成纖毛狀細(xì)管連接的接合（conjugation），通過(guò)這細(xì)管遺傳物質(zhì)可在兩個(gè)細(xì)

11、菌間傳遞。③質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的。這點(diǎn)不同于線粒體，線粒體DNA也是環(huán)狀雙鏈分子，也有獨(dú)立復(fù)制的調(diào)控，但線粒體的功能是細(xì)胞生存所必需的。線粒體是細(xì)胞的一部分，質(zhì)粒也往往有其表型，其表現(xiàn)不是宿主生存所必需的，但也不妨礙宿主的生存。某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒，帶有R質(zhì)粒的細(xì)菌