核酸雜交的基本原理

1、核酸雜交的基本原理核酸雜交的基本原理?原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則可以形成原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則可以形成雙鏈。雙鏈?；蚪M探針CDNA探針RNA探針的特點(diǎn)?基因組基因組DNA探針：為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。探針：為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。?制備：基因克??；制備：基因克??；PCR擴(kuò)增基因組特定片段擴(kuò)增基因組特定片段?優(yōu)點(diǎn)：

2、多克隆在載體中的優(yōu)點(diǎn)：多克隆在載體中的DNA片段，可以無(wú)限繁殖，量大；片段，可以無(wú)限繁殖，量大；PCR制備探針更加簡(jiǎn)制備探針更加簡(jiǎn)便省時(shí)。便省時(shí)。?cDNA探針：指互補(bǔ)于探針：指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。分子。?制備：以制備：以mRNA為模板，按照堿基互補(bǔ)的原則，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成的。為模板，按照堿基互補(bǔ)的原則，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成的。?優(yōu)點(diǎn)：不存在內(nèi)含子和高度重復(fù)序列，是一種較為理想的核酸探針。優(yōu)點(diǎn)：不存在內(nèi)含子和高度重復(fù)序列，是一種

3、較為理想的核酸探針。?RNA探針：以探針：以DNA兩條鏈中的任意一條為模板轉(zhuǎn)錄生成兩條鏈中的任意一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。?優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性高，雜交效率高，優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性高，雜交效率高，?缺點(diǎn)：易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜。缺點(diǎn)：易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜。探針標(biāo)記的方法理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具備以下特性：理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具備以下特性：?敏感性高；敏感性高；?標(biāo)記物與探針結(jié)合后，不影響雜交反應(yīng)，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和標(biāo)記物與探針結(jié)合后，不影響雜交反應(yīng)

4、，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值；值；?檢測(cè)方法要高靈敏性、高特異性、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、假陽(yáng)性率低；檢測(cè)方法要高靈敏性、高特異性、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、假陽(yáng)性率低；?標(biāo)記對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)人體無(wú)損傷，價(jià)格低；標(biāo)記對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)人體無(wú)損傷，價(jià)格低；?標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)方法無(wú)干擾。標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)方法無(wú)干擾。放射性同位素標(biāo)記放射性同位素標(biāo)記?放射性同位素標(biāo)記法放射性同位素標(biāo)記法缺口平移法缺口平移法隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法DNA探針的末端標(biāo)記探針的末端標(biāo)記5’端標(biāo)記法3

5、’端標(biāo)記法PCR標(biāo)記標(biāo)記DNA探針探針?lè)欠派湫詷?biāo)記非放射性標(biāo)記酶促反應(yīng)標(biāo)記法酶促反應(yīng)標(biāo)記法化學(xué)修飾標(biāo)記法化學(xué)修飾標(biāo)記法各種固相雜交方法的適用范圍各種固相雜交方法的適用范圍雜交類型雜交類型檢測(cè)目的及范圍檢測(cè)目的及范圍Southern印跡雜交印跡雜交檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子分子Nthern印跡雜交印跡雜交檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的RNA分子分子菌落雜交菌

6、落雜交檢測(cè)固定在膜上、經(jīng)裂解從細(xì)菌體釋放的檢測(cè)固定在膜上、經(jīng)裂解從細(xì)菌體釋放的DNA分子分子?RNA極易降解，提取過(guò)程中需注意極易降解，提取過(guò)程中需注意RNA酶污染；酶污染；?雜交前實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用器材最好與雜交前實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用器材最好與Souther印跡實(shí)驗(yàn)的分開使用，防止印跡實(shí)驗(yàn)的分開使用，防止RNA酶的酶的污染；污染；?RNA變性的方法與變性的方法與DNA不同；不同；?印跡前將含甲醛印跡前將含甲醛(變性劑變性劑)的凝膠用水沖洗掉，然

7、后再印跡、雜交；的凝膠用水沖洗掉，然后再印跡、雜交；?如果測(cè)定如果測(cè)定RNA片段大小，可在同一塊膠上加上分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)片段大小，可在同一塊膠上加上分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切下、上色、照像，樣品膠則進(jìn)行記物切下、上色、照像，樣品膠則進(jìn)行Nthern轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印。5.原位雜交原位雜交?定義：是以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針，與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)定義：是以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針，與細(xì)胞或組織切

8、片中核酸進(jìn)行雜交并對(duì)其檢測(cè)的方法。行雜交并對(duì)其檢測(cè)的方法。基本方法：基本方法：A.細(xì)胞或組織切片的處理細(xì)胞或組織切片的處理B.增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性C.預(yù)雜交預(yù)雜交D.雜交雜交E.雜交后處理雜交后處理F.結(jié)果檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)?生物芯片：指包被在固相載體上的高密度生物芯片：指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細(xì)胞或組織的微點(diǎn)、抗原、抗體、細(xì)胞或組織的微點(diǎn)陣(mic

9、roarray)。?主要特點(diǎn)：高通量、微型化和自動(dòng)化主要特點(diǎn)：高通量、微型化和自動(dòng)化?未來(lái)十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。未來(lái)十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。常用的生物芯片的分類：常用的生物芯片的分類：?基因芯片基因芯片?蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片?縮微芯片實(shí)驗(yàn)室縮微芯片實(shí)驗(yàn)室基因芯片基因芯片?又稱又稱DNA芯片或芯片或DNA微陣列。微陣列。?將大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，稱為基因芯將大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片

10、或纖維膜等載體上，稱為基因芯片。片?；蛐酒脑砼c制備基因芯片的原理與制備?根據(jù)核酸雜交的原理，將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜根據(jù)核酸雜交的原理，將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析。交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析。DNA芯片技術(shù)包括四個(gè)主要步驟：芯片技術(shù)包括四個(gè)主要步驟：?芯片的設(shè)計(jì)與制備芯片的設(shè)計(jì)與制備?樣品制備樣品制備?雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè)