單元3 菌種保藏與復(fù)壯

1、單元單元3菌種保藏與復(fù)壯菌種保藏與復(fù)壯模塊1菌種的保藏菌種的保藏在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟價值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟價值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。菌種保藏的意義菌種保藏的意義菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進行有關(guān)生產(chǎn)如抗菌種是從事微生物學(xué)以及

2、生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進行微生物學(xué)研究和微生物生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)

3、化。菌種保藏的原理菌種保藏的原理?菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于干燥和低溫，使菌種處于“體眠體眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。狀態(tài)，抑制其繁殖能力。?一種好的保藏

4、方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟，以便生產(chǎn)上能推廣使用。法本身的簡便和經(jīng)濟，以便生產(chǎn)上能推廣使用。?一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件?(1)經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；?(2)保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝保證高產(chǎn)突變株不改

5、變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。?(3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。?一、微生物菌種保藏一、微生物菌種保藏要求在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本方法：由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，因此，在具由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，

6、因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜合考體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜合考慮。慮。對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。液體石蠟法液體石蠟法甘油管法甘油管法砂管保藏法

7、砂管保藏法砂土管保藏法砂土管保藏法濾紙片保藏法濾紙片保藏法麩皮保藏法麩皮保藏法冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法液氮冷凍法液氮冷凍法蒸餾水懸浮保藏蒸餾水懸浮保藏最簡單的菌種保藏方法，只要將菌種懸浮于無菌蒸餾水中，將容器封好口，于最簡單的菌種保藏方法，只要將菌種懸浮于無菌蒸餾水中，將容器封好口，于10℃保藏即可達(dá)到目的。好氣性細(xì)菌及酵母菌等可用于此法。保藏即可達(dá)到目的。好氣性細(xì)菌及酵母菌等可用于此法。2.1冷凍保藏冷凍保藏冷凍保藏為保藏微生物菌

8、種的最簡單而有效的方法。冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在求在20℃以下，同時應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。以下，同時應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍

9、速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點之一是培養(yǎng)物運輸較困難。冷凍深藏的缺點之一是培養(yǎng)物運輸較困難。冷凍保藏種類冷凍保藏種類一、普通冷凍保藏技術(shù)一、普通冷凍保藏技術(shù)(20℃)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(60一80℃)三、液氮冷凍保藏技術(shù)三、液氮冷凍保藏技術(shù)普通冷凍保藏技術(shù)普通冷凍保藏技術(shù)(20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，

10、然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在5～20℃的普通冰箱的普通冰箱(20℃)中。或者，將菌種培中?；蛘撸瑢⒕N培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。年。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培

11、養(yǎng)物不宜再用來保藏。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。超低溫冷凍保藏技術(shù)超低溫冷凍保藏技術(shù)(60一80℃)要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在60℃以下進行保藏。以下進行保藏。

12、在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：1離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞；離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞；2用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；3加入等體積的加入等體積的20％甘油或％甘油或10％二甲亞砜；％二甲亞砜；4混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱中保藏。如果待保藏菌種生長在斜面上，則

13、可用含如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在12℃／min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏藏方法保藏5年而活力不受影響。年而活力不受影響。三、液氮冷凍保藏技術(shù)三、液氮冷凍保藏技術(shù)(一)冷凍保護劑冷凍保護劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一