常用菌種保藏方法

1、微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的。一、保藏方法大致可分為以下幾種：一、保藏方法大致可分為以下幾種：1、傳代培養(yǎng)保藏法、傳代培養(yǎng)保藏法又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內(nèi)保

2、存。2、液體石蠟覆蓋保藏法、液體石蠟覆蓋保藏法是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長保藏時(shí)間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。3、載體保藏法、載體保藏法是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。4、寄主保藏法、寄主保藏法用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如

3、病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。5、冷凍保藏法、冷凍保藏法可分低溫冰箱（20—30℃，50—80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約70℃）和液氮（196℃）等保藏法。6、冷凍干燥保藏法、冷凍干燥保藏法先使微生物在極低溫度（70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。有些方法如濾

4、紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對細(xì)胞的損害。保護(hù)性溶質(zhì)可通過氫和離子鍵對水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。保護(hù)劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。二、器材二、器材:細(xì)菌、酵母菌，放線菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，滅菌脫脂牛乳，滅菌水，化學(xué)純的液體石蠟，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，干冰，95％酒精，10％鹽酸，無水氯化鈣；滅菌吸管，滅菌滴

5、管，滅菌培養(yǎng)皿，管形安瓿管，淚滴形安瓿管（長頸球形底），40目與100目篩子，油紙，濾紙條（0512cm），干燥器，真空泵，真空壓力表，噴燈，L形五通管，冰箱，低溫冰箱（30℃），液氮冷凍保藏器。三、操作步驟、各保藏法的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)三、操作步驟、各保藏法的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)下列各法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件與需要選做。1、斜面低溫保藏法、斜面低溫保藏法將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2—8℃的冰

6、箱中保孢子懸液。（9）于每支沙土管中加入約05ml（一般以剛剛使沙土潤濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻。（10）放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽干時(shí)間越短越好，務(wù)使在12小時(shí)內(nèi)抽干。（11）每10支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查。（12）若經(jīng)檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存。每

7、半年檢查一次活力和雜菌情況。（13）需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣，效果亦好，可保存2年左右，但應(yīng)用于營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。5、液氮冷凍保藏法、液氮冷凍保藏法（1）準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用7510mm的，或能容12mm液體的。（2

8、）加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí)，則將空安瓿管塞上棉塞，105kgcm2，1213℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用105kgcm2，1213℃滅菌15分鐘。（3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，

9、放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。（4）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。（5）保藏經(jīng)凍結(jié)至30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ14）的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為150℃，液態(tài)氮內(nèi)為196℃。（6）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到

10、全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。6、冷凍干燥保藏法、冷凍干燥保藏法（1）準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ15），大小要求外徑6—75mm，長105mm，球部直徑9

11、—11mm，壁厚06—12mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，105kgcm2，1213℃滅菌30分鐘，備用。（2）準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯(cuò)，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期，若用對數(shù)生長期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求24—48小時(shí)的培養(yǎng)物；酵母需培

12、養(yǎng)3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7—10天。（3）制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝02ml。（4）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價(jià)值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達(dá)到同樣的目的。將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鐘，即可使懸液結(jié)冰