菌種保藏和使用技術

1、菌種保藏和使用技術,浙江省食品藥品檢驗所王知堅,2,菌種保藏和使用的有關概念菌種保藏和使用的有關法規(guī)我所現有菌種保藏管理規(guī)程基層單位可以使用的菌種保藏使用技術有關菌種問題的答復,3,概念,標準菌株：由國內或國際菌種保藏機構保藏的，遺傳學特性得到確認和保證并可追溯的菌株。標準儲備菌株：由標準菌株經一次傳代得到的培養(yǎng)物。商業(yè)派生菌株：由供應商提供的所有特性與標準菌株等效的菌株。代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并希

2、望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。工作菌株：由標準儲備菌株經傳代得到的培養(yǎng)物。,4,中國醫(yī)學菌種保藏中心提供的標準菌株,5,美國國家菌種保藏中心提供的標準菌株,6,法國生物梅里埃公司提供的商業(yè)派生菌株（Bioball),7,我所現在保藏的標準儲備菌株,8,我所以往保藏的標準儲備菌株,9,我所制備的工作菌株,10,法規(guī),中國藥典2005年版中國藥典2010年版實驗室認可準則其他行業(yè)標準,11

3、,中國藥典2005年版無菌檢查法：靈敏度檢查項下 菌種 培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。微生物限度檢查法：細菌、霉菌及酵母菌計數項下 菌種 同無菌檢查法,12,中國藥典2010年版在方法的附錄中對菌種的規(guī)定同2005年版在新增的“藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則”中對菌種有了較為明確的規(guī)定允

4、許使用標準菌株和商業(yè)派生菌株標準菌株應按保藏機構提供的說明進行復活標準儲備菌株應進行純度和特性確認標準儲備菌株建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍保藏的方法標準儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉種的工作菌株冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用工作菌株不可替代標準菌株，商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株,13,實驗室認可準則檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明（CNAS-CL09）實驗室必須保存有滿足試驗

5、需要的標準菌種或參照標本標準菌種或標本必須從認可的菌種或標本收集途徑獲得。實驗室必須建立和保存其所有菌種、標本的收集、貯藏、保存、確認試驗的記錄實驗室應有文件化的程序管理參照菌種（從原始菌種到日常工作用菌）。該程序應包括：參照菌種必須定期轉種傳代，并做確認試驗，包括實驗室中所需要的關鍵診斷指標，實驗室必須加以記錄并予以保存,14,每一支參照菌種都應以適當的標簽、標記或其它標識方式來表示其名稱、標準號、接種日期和所傳代數其管理記錄

6、中還應包括（但不限于）以下內容：從原始菌種傳代到工作用菌種的代數；菌種生長的培養(yǎng)基及孵育條件；菌種生存條件。,15,其他行業(yè)標準實驗室質量控制規(guī)范食品微生物檢測（GB/T 27405-2008）實驗室應制訂并實施特定程序管理和使用標準培養(yǎng)物實驗室應通過標準培養(yǎng)物來驗收培養(yǎng)基、驗證方法和評估實驗操作實驗室可使用來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有特性等效的商業(yè)派生菌株標準菌株傳代培養(yǎng)一次，制得標

7、準儲備菌株，同時應進行確認試驗。建議使用深度冰凍或凍干的方法制備標準儲備菌株。標準儲備菌株經繼代培養(yǎng)獲得工作菌株。一旦標準儲備菌株被解凍，最好不要重新冷凍和再次使用。工作菌株不可替代標準菌株。標準菌株的商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株。標準菌株發(fā)生變化經驗證不符合規(guī)定應及時銷毀。,16,我所的菌種管理規(guī)程,菌種的采購菌種的復蘇菌種的傳代菌種的保藏菌種的使用和銷毀,17,菌種的采購每年年底，由實驗室菌種管理人員提出下一年度菌種

8、采購的計劃，計劃購置的菌種一般為藥典收載的標準菌種，填寫請購單，經批準后，由所采購部門向指定的菌種保藏機構購置。所購菌種均為冷凍干燥菌種。 采購部門購入菌種后，應及時移交實驗室。實驗室菌種管理人員應仔細核對菌種發(fā)放單和冷凍干燥菌種管標簽等各項信息，確認無誤后，置4～6℃暫存。,18,菌種的復蘇菌種在打開前應仔細核對標簽上菌名、菌號。并注意一株菌種使用一套打開用具，嚴防交叉污染。 菌種復蘇應在生物安全柜內操作。 大腸埃希菌、金黃

9、色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同時接種液體培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基斜面，枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、藤黃微球菌和黑曲霉可接種瓊脂培養(yǎng)基斜面。 取瓊脂培養(yǎng)基斜面上的菌苔按要求對菌種的純度進行鑒定。,19,菌種的傳代應在生物安全柜中進行菌種的傳代 。取經過純度鑒定的第1代菌種管（瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物）用于傳代制備第2代菌種。接種完畢，液體培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基斜面應在規(guī)定的溫度下培養(yǎng)適宜的時間，芽孢桿菌宜培養(yǎng)5～6天

10、，黑曲霉宜培養(yǎng)5～7天，其他菌種一般培養(yǎng)18～24小時。,20,菌種的保藏保存的容器為無菌凍存管，保藏溫度為-70℃。 在冷凍前，應貼上菌種標簽。標簽內容應包括菌名、菌號、傳代日期和有效期。所有凍存管應立即置低溫冰箱中，迅速冷凍。該方法保藏菌種的有效期規(guī)定為6個月 。,21,菌種的使用和銷毀本所保藏的菌種主要供本所檢驗工作使用并可對外提供給有關涉藥單位。本所提供的菌種為第二代低溫冷凍菌種。 本所檢驗工作所需菌種，領用人應向菌

11、種管理人員領取，并在《菌種領用記錄》上記錄菌名、數量、領用人等信息。 外單位向我所購買菌種，應憑單位介紹信，并注明菌名、菌號、數量，必要時可預約購買。本所保藏的菌種，一般應每年更換原種（每年打開一套冷凍干燥菌種傳代制備第1代原種保存）。過期菌種應及時銷毀，銷毀時應經121℃ 20分鐘的生物滅活處理。,22,我所對外提供菌種時所附的菌種使用說明和發(fā)放證明 菌種證明（2009年版）.doc,23,基層單位可使用的技術,

12、通過制備工作菌種進行菌種保藏的方法通過制備標準儲備菌種進行菌種保藏的方法,24,通過制備工作菌種進行菌種保藏的方法從我所采購超低溫冷凍的標準儲備菌株（第二代）將所購菌株置4～6℃暫存，并盡快制備工作菌種準備足夠數量的瓊脂斜面培養(yǎng)基在生物安全柜內取標準儲備菌株1接種環(huán)，劃線接種至斜面上，重復操作直至所有斜面均被接種將所有斜面培養(yǎng)基置適宜的溫度培養(yǎng)適宜的時間觀察培養(yǎng)的情況，取其中1支進行鏡檢和必要的確認實驗確認符合要求的工作

13、菌種進行必要的標識，置4～6℃保藏（第三代）在規(guī)定的保存期內，取上述斜面培養(yǎng)物用于各種實驗至失效期前，取其中1支重復接種斜面培養(yǎng)基，制備第四代工作菌種,25,通過制備工作菌種進行菌種保藏的方法優(yōu)點操作簡便成本低比較容易掌握缺點保存期比較短反復傳代有引起變異的可能,26,27,通過制備標準儲備菌種進行菌種保藏的方法準備低溫冰箱，溫度應能達到-30℃，最好能夠裝備超低溫冰箱，溫度達到-70℃準備適宜的液體培養(yǎng)基將采購

14、來的標準儲備菌株在生物安全柜內吸取適量接種至液體培養(yǎng)基中將培養(yǎng)基置適宜溫度培養(yǎng)適宜時間取適量培養(yǎng)物進行鏡檢和必要的確認實驗確認符合要求后，在生物安全柜內，向上述液體培養(yǎng)物中加入15～20％（V/V）的無菌甘油，混勻取1～2ml上述混合物，置無菌凍存管或無菌離心管內進行必要的標識置低溫冰箱中冷凍取凍存管1支，解凍后，制備當月使用的工作菌種,28,通過制備標準儲備菌種進行菌種保藏的方法優(yōu)點保存期較長反復傳代導致菌種變異的

15、風險較小缺點操作相對復雜成本較高操作流程相對較長，受到污染的風險較高,29,,通過制備標準儲備菌種進行菌種保藏的模式圖,30,有關菌種問題的答復,陽性菌的制備：領取工作菌種，從斜面上取一定量的培養(yǎng)物，稀釋至系列梯度的菌懸液，分別測各梯度菌懸液的菌落數。臨用時，取相應稀釋菌懸液用于陽性試驗，同時用平皿法測定加入的菌液中的菌落數。是否可行？對照用菌液的制備應取工作菌種，接種置適宜的液體培養(yǎng)基中，經培養(yǎng)后獲得濃菌液，再進行稀釋和確定

16、菌濃度,31,菌種鑒定簡單的講可以采用目前比較成熟的商品化鑒定技術，如API鑒定條基本程序為：對疑似菌種進行純培養(yǎng)進行染色鏡檢根據染色情況，并結合顯色培養(yǎng)基等鑒定的初步信息，選擇合適的鑒定條根據操作說明書，得到各生化反應的鑒定結果，通過查閱檢索表，得到菌種鑒定的初步結果也可以采用半自動或全自動的微生物鑒定系統(tǒng),32,請教黑曲霉及白色念珠菌具體傳代及培養(yǎng)技術，操作中有何注意點？采用的培養(yǎng)基應為改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖

17、瓊脂培養(yǎng)基傳代操作建議在生物安全柜內進行白色念珠菌斜面培養(yǎng)基的傳代：取斜面培養(yǎng)的菌種管，用接種環(huán)取1白金耳，在待接種的培養(yǎng)基斜面上劃線接種，培養(yǎng)即可液體培養(yǎng)基的傳代：取液體培養(yǎng)的菌種管，用毛細吸管取適量，在待接種的培養(yǎng)基斜面上涂布接種，培養(yǎng)即可培養(yǎng)條件：20～25℃，24小時,33,黑曲霉斜面培養(yǎng)基的傳代：取斜面培養(yǎng)的菌種管，用滅菌水或滅菌生理鹽水（也可以按照2010年版藥典公示稿的方法）3～5ml洗脫孢子，吸取孢子懸液，在

18、待接種的培養(yǎng)基斜面上涂布接種，培養(yǎng)即可孢子懸液的傳代：取孢子懸液，用毛細吸管取適量，在待接種的培養(yǎng)基斜面上涂布接種，培養(yǎng)即可培養(yǎng)條件：20～25℃，4～5天注意點減少形成氣溶膠的操作佩戴手套和口罩進行操作,34,生孢梭菌計數：用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒皿，厭氧罐培養(yǎng)長不出來，經確認菌是有活性的，厭氧指示顏色正確，-5，-6，-7均無菌落生長對于生孢梭菌的計數，建議將所有稀釋級均注皿培養(yǎng)培養(yǎng)中的厭氧環(huán)境對生長與否是決定性的有條件的

19、實驗室建議采用厭氧培養(yǎng)工作站小型的厭氧培養(yǎng)可采用厭氧培養(yǎng)罐，但應嚴格按照使用說明操作，注意厭氧試劑、厭氧指示劑、催化劑的有效性,35,如何對菌種進行復壯，傳代之前是否一定要做微生物學鑒定，確認是否有變異。復壯的方法應根據待復壯的菌種的保藏形式來確定。對凍干菌種，復壯操作較為繁瑣微生物傳代中的菌種確認是必須的,36,陽性對照是否必須購買菌種？菌種應該怎樣保存？有效期一般為多長時間？對照用菌種應采用標準菌種，一般應外購保存方法如前

20、述有效期根據不同菌種，不同的保藏方法而異，如采用斜面移植保藏法，不能形成芽孢的細菌有效期一般為1個月，能形成芽孢的細菌有效期一般為3個月，真菌的有效期為3個月。,37,銅綠假單胞菌在半固體培養(yǎng)基中生長不是很好，應如何保藏較好？菌種銅綠假單胞菌保存時放冰箱好還是室溫好，貯存過程中菌種變色是否不能使用？因銅綠假單胞菌有運動性，因此在半固體培養(yǎng)基中穿刺培養(yǎng)后無法形成穿刺線。接種時，將半固體取出直接在培養(yǎng)基上涂布即可。也可以采用超低溫冷

21、凍的方式保藏，效果好斜面保藏的菌種在冰箱中放置應注意控制溫度，一般不宜低于4℃，也可以放置在室溫中，但應控制溫度不超過25 ℃。菌種保存過程中，的確會存在色素退化 的情況，此時對菌種進行傳代培養(yǎng)，即可重新表現出色素，仍可使用。,38,今年購買的菌液接種后，生長出來較稀薄，是否因為混勻的關系，但放置菌液的瓶子混勻感覺也不是安全，請問是否有更好的方法，或者是否能仍提供固體培養(yǎng)基的菌種建議采用瓊脂斜面培養(yǎng)基復壯上述超低溫冷凍標準儲備菌株。

22、從這些斜面培養(yǎng)基上取培養(yǎng)物接種，制備工作用濃菌液，其濃度可以得到保證,39,短小芽孢桿菌如何鑒定通過顯微鑒別，為不呈鏈狀排列的桿菌，革蘭氏染色為陽性。營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔光滑，薄，閃光，蔓延，不粘著，常常是淺黃色。 生化試驗可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原 ，結果為明膠緩慢液化，淀粉水解陰性，硝酸鹽還原陰性。采用API鑒定條，結合染色鏡檢和接觸酶實驗等結果,40,菌種傳代至第5代時，還能不能用該斜面菌種接種制備工作用菌液嚴格

23、講，這種操作是不符合藥典規(guī)定的。藥典所指的傳代次數不超過5代，應該是指用于實驗的工作用菌液。因此，從保藏的角度看，制備成的斜面保藏菌種只能到第4代。,41,菌種的常識，如菌種的保存、適宜的生長環(huán)境及存活時間、常見菌種的形態(tài)細菌：斜面保藏法：一般使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，生孢梭菌使用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，在30～35℃培養(yǎng)18～24小時。存活時間1～3個月。低溫冷凍保藏法：一般使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，生孢梭菌使用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，在30～