生產中常用菌種的分離、選育和保藏

1、生產中常用菌種的分離、選育和保藏,主講人：韓北忠 劉 萍,帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種顯微觀察裝置,第一節(jié) 菌種的分離簡介,一、菌種的來源根據資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。,二、分離思路,新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產用

2、菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設備與之配合。,定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術得到純種。發(fā)酵性能測定：進行生產性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產品品種和產量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫

3、度、最適pH值、提取工藝等。,三、新種分離與篩選的步驟,（一）采樣,1、采樣對象 以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。,,從自然界篩選,2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當地點后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛

4、入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。,（二）增殖培養(yǎng),為了容易分離到所需的菌種，讓無關的微生物至少是在數量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物

5、就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。,（三）培養(yǎng)分離,盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應進一步應用，而且控制得細一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。,（四）篩 選,這一步是采用與生產相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產用菌種。,（五）毒性試驗,自然界的一些微生物是在一定條

6、件下產毒的，將其作為生產菌種應當十分當心，尤其與食品工業(yè)有關的菌種，更應慎重。據有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。,第二節(jié) 培養(yǎng)分離,從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎的步驟。 到目前為止，還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個試樣中所包含的所有微生物總數和種類。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數特定種類的菌株

7、；在工業(yè)微生物篩選過程中，應及時調整檢測方法，以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應。因此，建立一更為科學的和針對性不強的分離方法是必要的。,一、成功的分離培養(yǎng)方法,(1)認真考它所需產品的特征和生產過程；(2)制訂初步的篩選標準；(3)將生態(tài)學方法運用到分離和篩選過程。,二、培養(yǎng)分離中要解決的問題,1、“分離什么和從哪里分離出?” 2、必須充分考慮所分離微生物的生產能力、生長速度、生物群體培養(yǎng)和產品生產工藝及其提純的

8、難易和費用，工業(yè)生產發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等。3、選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測方法。,三、將生態(tài)學方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點,1．羅列出所要分離的微生物類群；2．根據所采集樣本的各種生態(tài)參數，描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地：3．將若干樣本分成若干類型，如植物和植物各部，土壤(類型和土層)、巖石、水、昆蟲和發(fā)酵食品等；4．羅列出所要考察和測量的環(huán)境參數，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢及溫度等；,5．列出

9、生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質、葡萄表皮的果膠； 6．根據上述1-5項中所獲得的數據，設計分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件； 7．用標準方法作對照來評價生態(tài)學分離方法； 8．根據待檢材料的生態(tài)參數需要，修改已知的方法； 9．運用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。,四、自然界中細菌的分離,(一)采樣和采集方法,為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代

10、表性的細菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現的菌群時，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。,采樣的注意事項,1、采樣時應盡可能保持相對無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數等；4、應充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，因為真正的原地菌群的出現可能是短暫的；,,5、

11、采好的樣應及時處理，暫不能處理的也應貯存于4℃下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現消長,1．土樣采集方法,森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；水田等浸水土壤在不損土層結構的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴格，可取離地面5～15cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根際土樣時，一般方法是自土壤

12、中慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。,2．植物體采集方法,在采集葉面時，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。選擇葉面時應考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時，一般與根際土樣一起保存。,

13、3．水樣采集方法,用于細菌檢測的水樣應收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，故在采樣時應在較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進入。如果有急流存在的話，應直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時應迅速并帶有較大的弧度。水樣不應裝滿采樣瓶。所有水樣都應在24h之內迅速進行檢測，或者4℃下貯存。,(二)生態(tài)學參數及培養(yǎng)基的組成原則,1、加入培養(yǎng)基中

14、的天然提取物種類和用量、環(huán)境生物物理學參數以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會影響實驗中所要分離的細菌的數量和種類。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應含有多種碳、氮源，如幾丁質、纖維素或果膠。,3、所有分離培養(yǎng)基中都應含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50μg／m1， 以抑制真菌的生長。4、瓊脂平板在使用前應置于37℃培養(yǎng)箱中孵育l、2

15、天。5、培養(yǎng)基的生物物理學參數，如pH及鹽分也應調節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數值相近。,土中細菌的富集培養(yǎng)與分離,分離土樣中的大部分細菌的分離程序中無需進行富集。但對某些少數細菌則要求特殊的富集或選擇技術才能很好地被分離培養(yǎng)。,富集方法,運用細菌的酶誘導性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復雜底物及生長因子的前體物質來激活細菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術。富集可以促進抗性的產生并維持下來。,土樣中細菌的富集：適度稀釋后，取0.

16、1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質、纖維素等)的土浸出汁平板。植物體上細菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經適度稀釋后涂布平板。水中細菌的分離：水樣通過0.22μm無菌濾膜，取出濾膜用1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)或濾紙壓印分離法。,水中細菌分離的簡易富集技術,在無菌的、用棉團塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上；在不同水體的水樣

17、中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質等，同樣可以促進水中微生物的增殖。培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長。另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細菌“附著材料”，如無菌的植物組織或土壤浸出液。通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細菌、中溫菌和嗜高溫菌。,次代培養(yǎng)及純化步驟,1、涂布的平板經培養(yǎng)后，如生長出菌落，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對瓊脂平板進行分類。2、用無菌牙簽將菌落轉接到篩選平板上

18、及轉接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上。3、篩選平板經培養(yǎng)后，按生長出菌落的形態(tài)學特征如色素、菌落形態(tài)等進行最初分組。4、將認為有希望的菌落用牙簽轉接到另一模擬分離瓊脂平板上進行篩選。,五、放線菌的分離,(一)采樣及采集方法應盡可能實行無菌操作。所采集的樣本應具有一定的代表性。樣本采集完后，應及時處理或在4℃下貯存，貯存試樣處應與劃線，篩選平板分開，貯存時間不宜過長。,(二)生態(tài)學參數,放線菌分離培養(yǎng)過程中所需考慮的

19、生態(tài)參數有溫度、pH、離子強度、氧化還原電勢和底物濃度。,（三）培養(yǎng)基的組成原則,大多數放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復雜底物的瓊脂平板上進行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應在37℃培養(yǎng)箱中存放3天。,放線菌的分離,土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風干，磨碎，無菌海

20、綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細菌數量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進行系列稀釋和涂布。,次代培養(yǎng)及純化,菌落形成后可根據肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過高倍放大進行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線

21、菌屬及種的關鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進行影印培養(yǎng)，以進一步篩選和分離。,六、真菌分離,1、利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計數，分離和鑒定。這里主要是利用營養(yǎng)成分的減少而使生長減慢，并由此限制真菌的遷涉生長。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌

22、的分離。3、有時，真菌子實體形成必須有光線，這在分離培養(yǎng)時應加以考慮。,4、選擇性富集：是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數量上的增加而利于分離的一種技術。 富集可以是種水平的，如通過營養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標微生物消除或減少到一定程度。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效

23、地抑制細菌生長及菌落形成。,真菌的分離方法,土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過篩法，庶糖密度梯度離心法。植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。餌誘技術常用于水中真菌的富集。子實體直接分離培養(yǎng)擔子菌：新采集的子實體組織植入平板內或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無菌濾紙上培養(yǎng)。,七、生產選種,是在長年累月的生產實踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變

24、更情況下，突然發(fā)現某些批次生產水平提高較大，這就有可能是個別自然變異朝更好的方向變的細胞，在這種條件下很適應于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長優(yōu)勢，這種優(yōu)勢的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產性能表露。進行類似新種篩選分離，達到獲得新的優(yōu)良生產菌種的目的。,第三節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針,工業(yè)菌種的育種： 是運用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質或增加

25、新的性狀。,工業(yè)菌種育種的方法,誘變基因轉移基因重組,育種過程,包括下列3個步驟： (1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評價(包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產規(guī)模)。,選擇育種方法時綜合考慮的因素,(1)待改良性狀的本質及與發(fā)酵工藝的關系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗)； (2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學萬面認識的明了程度； (3)經濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工

26、藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術：如果對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。,工業(yè)菌種改良方法,(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數或增加相應基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。 (2)增加前體物的濃度。 (3)改變代謝途徑，減少無用副產品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或

27、產品的耐受力。,,(4)抑制或消除產品分解酶。 (5)改進菌種外泌產品的能力。(6)消除代謝產品的反饋抑制。如誘導代謝產品的結構類似物抗性。,提高特定基因的表達水平,(1)引入強轉錄及翻譯信號，可通過在一高效表達載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修改現有表達信號，提高基因效力等。(2)誘導解除基因表達抑制的突變。,改進菌種的生長效率,提高菌株對底物的利用率方法： a. 通過確定并改變代謝中的耗能部分; b. 由另

28、一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實現。 c. 賦予菌種對多種底物，特別是價廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費用。,第四節(jié) 誘變育種,以微生物的自然變異作為基礎的生產選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A的育種，是迄今為止國內外提高菌種產量、性能的主要手段。,誘變,物理、化學或生物誘變方法,一、誘變劑和誘變處理,物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；

29、物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設備中使用，否則有一定危險性。,化學誘變劑：化學因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學誘變劑的優(yōu)缺點：1、大多數情況下，就突變數量而言，要比電離輻射更有效。,,2、化學誘變劑是很經濟

30、的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射±行工作時，設備費用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當心。,誘變劑的選擇,1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應用的范圍較廣，造成的遺傳損

31、傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。,,3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。,二、誘變育種步驟,出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選,(一)出發(fā)菌株的選擇,1．自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。

32、2．在生產中經生產選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。,5．要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產基因。 6．根據采用的誘變劑或根據細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處理會使細胞產生抗性

33、，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。,(二)處理菌懸液的制備,這一步驟的關鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。,(三)誘變處理,根據前面有關誘變劑及誘變處理的介紹，結合誘變對象的實際，設計誘變處理方案。,(四)中間培養(yǎng),由于在發(fā)生了突變尚未表現出來之前，有一個表現延遲的過程，即細胞內原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，

34、需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。,,方法： 讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質復制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，隱性的變異就會顯現出來，若不經液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。,(五)分離和篩選,篩選分初篩和復篩。初篩以迅

35、速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復篩則是精選，以質為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異. 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產物與某些染料或基質的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者，而將90%的菌落淘汰。在數量減少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復篩階段，還應不斷結合自然分離，純化菌株。,紫外線的誘變育種,紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長

36、為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。,被照射的菌懸液細胞數，細菌為106個／ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106～107個／ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復活效應，所以照射時和照射后的處理應在紅燈下進行

37、。,(二)操作步驟 1．將細菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。 2．將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內過濾，單細胞濾液裝入試管內，一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數可達108個／ml左右，作為待處理菌懸液。,,3．取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下3

38、0cm處。在正式照射前，應先開紫外線10min，讓紫外燈預熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。,4．取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5ml進行稀釋分離，計數活菌細胞數。 5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。 6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7．挑取菌落進行篩選。,亞硝基胍誘變曲霉菌,N—甲基—

39、N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內的DNA復制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。,(二)操作步驟 1．單孢子懸液制備 取斜面，加入6ml 0.1mol／L pH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子

40、懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個／ml，此為待處理孢子懸液。 2．MNNG溶液的制備 用分析天平稱取2mg，加入2ml 0.1mol／L pH 6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。,3．誘變處理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30℃ 3天后計數。 4．死亡率計算 將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸

41、緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30℃下培養(yǎng)3天。根據處理前后的活孢子數可計算出死亡率。 5．挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產量篩選．,第五節(jié) 營養(yǎng)缺陷型的選育,營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。與營養(yǎng)缺陷型對應的是野生型。,能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分的稱補充培

42、養(yǎng)基(SM)；能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。,營養(yǎng)缺陷型的用途,營養(yǎng)缺陷型在生產上和科學研究上用途很大。目前生產氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。,篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟,誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜,一、誘變方法,物理誘變化學誘變,二、淘汰野生型,抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變

43、處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應加入一定量的抗生素，結果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。,三、檢出缺陷型,原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良

44、好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。 具體方法：影印法、點種法、夾層法,1．將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2．將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標記方位。3．將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復印于上。,(一)影印法,,4 ．將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5．二平皿相同方位進行比較， 即可發(fā)現在MM平皿上長出的菌落少

45、于GM平板上的。MM上未長而相應于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應有一定間隔。,(二)點種法,也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結果明確，但工作量大。,(三)夾層法,先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現的菌落標記，然后倒上

46、一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點是，結果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。,四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定,驗證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。,生長譜測定的方法,將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5～6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合

47、區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)?！獋€平皿測一個菌。,,以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應位置，培養(yǎng)后根據在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在5～6個平皿上可測20株菌以上。,第六節(jié) 基因育種,基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質?；蚱渌d體，將目的基因轉移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內進行復制和表達，或者通過細胞

48、間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)秀性狀經其間遺傳物質的交換而轉移給另—個細胞的方法。,一個完整的基因克隆過程包括以下步驟,１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導入宿主細胞；４、篩選、鑒定陽性重組子；５、重組子的擴增與／或表達。,2.2基因重組,一、質粒的特點,1、質粒的存在并非微生物生命活動必需。2、每個細胞中存在的質粒數稱為該質粒的拷貝數。不同類型的質粒其拷貝數各異，同一質粒在不

49、同條件下，拷貝數也可能差異很大，有嚴緊型和松弛型兩種。3、質粒DNA分子常呈現三種形態(tài)；常見的一種是共價、閉環(huán)狀DNA(CCC DNA)；其次是由于—條鏈有缺口而產生的開環(huán)DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產生的線性DNA。,質粒載體,二、各類質粒所賦予宿主細胞的不同表現型,抗生素抗性：抗生素的產生；大腸桿菌素的產生；腸毒素的產生；復雜有機化合物的降解；限制性核酸內切酶和修飾酶的產生；殺傷性能。 在自

50、然條件下，許多質?？山浖毦雍匣蛳嗨品绞皆谒拗鏖g相互轉移。在實驗室條件下，質粒也可經人工手段將其轉化入宿主細胞內。,三、質粒DNA的提取方法,細菌培養(yǎng)和質粒擴增；細菌的收獲和裂解；質粒DNA的提取。,四、遺傳轉化,轉化是指受體細胞直接攝取供體細胞游離的DNA片段，將其同源部分進行堿基配對，組合到自己的基因中，從而獲得供體細胞的某些遺傳性狀。,(二)操作步驟：質粒DNA轉化感受態(tài)大腸桿菌1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入10ml肉湯

51、培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。2．取0.5ml培養(yǎng)物接入50ml肉湯中，無菌添加0.4ml 2.5mol／LMgCl2，于37℃振蕩培養(yǎng)。3．將o.1mol／L CaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。,,4．當培養(yǎng)物OD600在o.5～o.8左右時，開始收獲細胞(大約需2～2.5h)．5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻10min。6．取10ml培養(yǎng)物置2個冷離心管中棄去上清液。,7．加入1ml 0.1mol／L CaCl2，再加0.9ml

52、CaCl2，置冰浴中放置20min。8．3000r／min離心10min，棄去上清液．9．加入1ml 0.1mol／L CaCl2，重新懸浮細胞，置冰浴中保存。10．加入1～20μl待轉化質粒 DNA溶液。,,11．在冰上放置20min，在37℃處理2min。再插入冰中．加入0.9m1肉湯37℃靜置培養(yǎng)90min。12．以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。13．于37℃培養(yǎng)過夜。鑒定轉化菌落。,常用的遺傳轉化系統(tǒng),1、自然系統(tǒng)2、

53、人工誘導（完整細胞）（1）二價陽離子系統(tǒng)：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++輔助噬菌體，Tris+Ca 2+（2）單價陽離子系統(tǒng)：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）凍融系統(tǒng)（4）Triton處理：人工誘導（PEG/原生質體）,重組DNA中常用的工具酶,包括限制性核酸內切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉錄酶等.,限制性內切酶,切開DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點。常用限制性內切酶種類及特性

54、,W. Arber,H. O. Smith,限制性內切酶的剪切方式,粘性未端：切開后的兩段DNA各留下一個尾，這2個尾的核苷酸順序完全一樣，中是方向相反。它們之間是互補的，在適當條件下可以再連接一起。,其它工具酶,連接酶T4 DNA修補工具酶DNA聚合酶I末端加工酶S1核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶末端轉移酶人工加polyA 或polyT 尾反轉錄酶,載體－宿主系統(tǒng),載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增

55、和表達的DNA；一般是通過改造質粒、噬菌體或病毒等構建的。,載體應具備以下條件：,１、能在適當的宿主細胞中復制；２、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源DNA插入；３、具有篩選標志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離；５、對于表達型載體還應具有與宿主細胞相適應的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。,宿主細胞必須符合以下條件,１、對載體的復制和擴增沒

56、有嚴格的限制；２、不存在特異的內切酶體系降解外源DNA；３、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；４、重組缺陷型，不會產生體內重組；５、容易導入重組DNA分子；６、符合重組DNA操作的安全標準。,目的基因的獲取,一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內切酶。cDNA：用mRNA反轉錄成單鏈DNA，再經DNA聚合酶的作用產生雙鏈DNA?？扇コ婧松锘蛑胁槐磉_的內含子。,,二、化學合成法

57、制備DNA片段從蛋白質肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。三、聚合酶鏈反應法擴增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應（ＰＣＲ），以基因組DNA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。,PCR技術,根據需擴增片段的兩端設計引物。使DNA解鏈（高溫），引物結合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應。特點：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。,DNA擴

58、增,,PCR反應,DNA片斷的克隆,載體的條件 ：,a 復制起點 b 適宜的限制酶切點c 選擇標記,DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組DNA技術的關鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。,一、DNA連接酶,DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自Ｔ４噬菌體的DNA 連接酶。T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：１、連

59、接具有同源互補粘性末端的ＤＮＡ片段；２、連接雙鏈DNA分子間的平端；３、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。,重組DNA導入宿主菌,體外連接的重組DNA分子必須導入適當的受體細胞中才能大量的復制、增殖和表達。根據所采用的載體的性質，將重組DNA分子導入受體可有不同的方法。,一、轉 化,指以細菌質粒為載體，將外源基因導入受體細胞的過程。轉化時，細菌必須經過適當的處理使之處于感受態(tài)－即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短

60、暫熱休克使DNA導入細菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉化細菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉化效率高、適用于任何菌株。,二、轉染和感染,利用噬菌體DNA作為載體時可經兩種方式導入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質粒一樣地轉化進受體菌。但習慣上常把以噬菌體DNA為載體構建成的重組子導入細胞的過程統(tǒng)稱為轉染。,重組克隆的篩選與鑒定,基因

61、克隆的最后一步是從轉化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養(yǎng)以及重組子的擴增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結構、功能，或表達該基因的產物。,一、抗藥性標志的篩選,如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如ampr或tetrr ，轉化后只有含這種抗藥基因的轉化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉化菌與非轉化菌區(qū)別開來。如果重組DNA時將外源基因插入標志基因內，該標志基

62、因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉化菌落。,二、β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選,很多載體都攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼β－半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸，稱為α－肽，它表達β－半乳糖苷酶的C-端肽鏈。當載體與宿主細胞同時表達兩個片段時，宿主細胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal 變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的α－互補。而重組子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互補，在

63、含X-gal的平板上，含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。,三、菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。四、內切酶圖譜鑒定經初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應的內切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內切酶消化鑒定插入的方向。,重組DNA的鑒定,遺傳學方法,第七節(jié) 雜交育種,

64、(一)細菌雜交,在細菌中實現雜交的種類尚不多，主要是大腸桿菌，其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒有F因子稱F-。F因子存在于細胞中形式：游離狀態(tài)(F+細胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質的一定位置上(Hfr細胞)。F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實質上是F因子的轉移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。,（二）酵母雜交育種技術,1、酵母繁殖方式 酵母為單

65、細胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經過特定條件的誘導，可使其產生單倍體孢子并可出芽產生單倍體繁殖體。,,單倍體細胞具α及ε2兩種交配型。兩種交配型細胞經其細胞壁上特定的凝聚因子誘導而進行交配，恢復為雙倍體；同一交配型細胞之間，則因細胞壁上凝集因子的存在而不能進行交配。在生活過程中，酵母細胞還可以形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細胞。,2、酵母雜交 一般而言，雜交育種運用了酵母的單雙倍生活周期，將不同

66、基因型和相對的交配型的單倍體細胞經誘導雜交而形成二倍體細胞，經篩選便可獲得新的遺傳性狀。酵母的雜交方法有孢子雜交法、群體交配法、單倍體細胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運用罕見交配法更易獲得結果。,第八節(jié) 原生質體育種,原生質體育種技術主要有原生質體融合、原生質體轉化技術，此外尚有原生質體誘變育種等。原生質休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學討論會上

67、提出來的。,一、原生質體融合育種的特點,(一)雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質體。(二)受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。(三)遺傳物質傳遞更為完整：原生質體融合是二親株的細胞質和細胞核進行類似的合二為一的過程。,(四)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。（五有可能采用產量性狀較高的菌株作融合親株。 (六)提高菌株產量

68、的潛力較大。 (七)有助于建立工業(yè)微生物轉化體系。,二、原生質體融合育種步驟,1．標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。2．原生質體制備。3．等量原生質體加聚乙二醇促進融合。4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。6．生產性能篩選。,三、原生質體融合育種的要點,（一）標記菌種的選擇 獲得標記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或／和抗藥性菌株。這里最重要的