實驗論文 (8)

1、鹿茸多肽對大鼠軟骨細胞增殖的影響鹿茸多肽對大鼠軟骨細胞增殖的影響作者：陳曉東林建華作者單位：巴彥淖爾市醫(yī)院骨科，內蒙古巴彥淖爾015000；福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院【摘要】目的：探討鹿茸多肽(PAP)對大鼠軟骨細胞體外增殖的影響。方法：采用二次酶消化法獲得大鼠關節(jié)軟骨細胞進行傳代培養(yǎng)并對第四代細胞進行藥物干預，利用MTT比色、免疫組化檢測增殖細胞核抗原（PCNA）、流式細胞術檢測細胞周期等方法來檢測各代次大鼠軟骨細胞和藥物干預后第四代軟

2、骨細胞的增殖情況。結果：大鼠軟骨細胞隨傳代培養(yǎng)，MTT比色顯示增殖呈下降趨勢，免疫細胞化學檢測PCNA表達減少，流式細胞術顯示細胞增殖指數下降PAP可以抑制這一趨勢促進傳代培養(yǎng)的細胞增殖能力。結論：PAP對傳代培養(yǎng)的大鼠軟骨細胞的增殖能力有明顯促進作用?！娟P鍵詞】鹿茸多肽；大鼠；軟骨細胞；增殖基金項目：福建省科技計劃重大資助項目(2004Y018)EffectofPiloseAntlerPolypeptidesonProliferati

3、onofRatChondrocyteinVitroCHENXiaodong，LINJianhua(DepartmentofthopedicsBayannaoerHospitalBayannaoer015000China)AbstractObjective:Thepurposeofthepresentwastoinvestigatetheeffectofpiloseantlerpolypeptides(PAP)ontheprolifera

4、tionofratchondrocyteinvitro.Methods:Theratarticularchondrocyteswereisolatedbyenzymedigestionsubcultivatedinserial.The4thchondrocytewasinterferedwithPAP.Thechondrocytesofdifferentgenerationsthe4thmedicineinteferedgenerati

5、onweredetectedwiththemethodsofproliferatingcellnuclearantigenMTT(methylthiazolyltetrazolium)assayfproliferationFlowcytometryfanalysesofcellcycledistributionPI(proliferationindex).Results:Withchondrocytespassagetimeincrea

6、singtheproliferatingabilityofchondrocytesdescended.MTTassayshowedthattheproliferatingabilityofchondrocytesdecreasedtheexpressionofPCNAtaperedintheexperimentofimmunohistochemistryPIdescendedinflowcytometryfanalyses.PAPcan

7、inhibitthetendencystrengthentheproliferatingabilityofchondrocytesinserialsubcultivation.Conclusion:PAPcansignificantlyimproveproliferationofchondrocytesinserialsubcultivation.濃度的PAP培養(yǎng)基，分別加藥使各瓶培養(yǎng)基藥物終濃度為PAP5μgmL、PAP10μgmL、

8、PAP15μgmL；分別以上述不同含藥濃度培養(yǎng)基吹打混勻各瓶P3細胞，進行傳代，使藥物干預組軟骨細胞進入P4代。按實驗要求調整細胞濃度，分別接種軟骨細胞于底面積25cm2培養(yǎng)瓶（細胞濃度5105mL）、6孔培養(yǎng)板（置入蓋玻片）（細胞濃度5105mL）、96孔培養(yǎng)板（細胞濃度4105mL），于37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中孵育，其中PAP分組參考劑量來源于前期實驗［3］。2.2各代軟骨細胞MTT比色試驗將不同代次大鼠軟骨細胞以5104

9、mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24小時后用含體積分數為5%FBS的αMEM培養(yǎng)，并分別加入PAP，使PAP終濃度為5、10、15μgmL加藥后分別繼續(xù)培養(yǎng)48小時，加入MTT溶液呈色。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各個孔光吸收值。2.3各代軟骨細胞周期分析及增殖指數檢測將培養(yǎng)的待測各代軟骨細胞分別置5mL試管中，用PBS或生理鹽水洗2次，制成單細胞懸液，無水乙醇固定細胞，加入PBS調整細胞濃度為5105～5106個細

10、胞加入1mLDNA熒光染料（PI），室溫下避光染色15分鐘，以流式細胞儀(BectonDickinsonFACScan，美國)分析各代軟骨細胞周期及檢測增殖指數。2.4各代軟骨細胞免疫細胞化法檢測各組軟骨細胞PCNA表達將不同代次軟骨細胞接種于6孔板，孔內均預置一塊蓋玻片，常規(guī)培養(yǎng)48小時后取出蓋玻片，用免疫組織化學二步法檢測PCNA表達情況，結果分析：采用HPIAS21000高清晰度圖像處理系統(tǒng)進行圖像分析，測定PCNA陽性信號的面積

11、密度(Sv=PCNA陽性信號面積和窗口面積窗口數)。2.5統(tǒng)計學方法以上檢測均隨機取多個樣本，每個樣本多次重復。應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析。進行OnewayANOVA檢驗和Pearson相關分析，定量資料實驗結果以均數標準差表示，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。3結果3.1各組軟骨細胞MTT比色結果MTT比色分析顯示：隨著軟骨細胞傳代培養(yǎng)，從P2代細胞至P4代軟骨細胞在傳代培養(yǎng)過程中細胞能量代謝呈下降趨勢，逐代相比OD值有顯著差