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1、蛋白質(zhì)純化方法蛋白質(zhì)濃縮有多種方法,有鹽析,超濾,離子交換,有機(jī)溶劑沉淀等方法。有機(jī)溶劑沉淀法:有機(jī)溶劑能降低溶液的電解常數(shù),從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力,導(dǎo)致溶解度的降低;另外,有機(jī)溶劑與水的作用,能破壞蛋白質(zhì)的水化膜,故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度差異而分離的方法,稱“有機(jī)溶劑分段沉淀法”,它常用于蛋白質(zhì)或酶的提純。使用的有機(jī)溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度有機(jī)溶劑易引起蛋白質(zhì)變性失活,操作必須在低溫下進(jìn)行,并在加入有機(jī)溶劑
2、時(shí)注意攪拌均勻以避免局部濃度過大。由此法析出的沉淀一般比鹽析容易過濾或離心沉降,分離后的蛋白質(zhì)沉淀,應(yīng)立即用水或緩沖液溶解,以降低有機(jī)溶劑濃度。操作時(shí)的pH值大多數(shù)控制在待沉淀蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近,有機(jī)溶劑在中性鹽存在時(shí)能增加蛋白質(zhì)的溶解度,減少變性,提高分離的效果,在有機(jī)溶劑中添加中性鹽的濃度為0.05molL左右,中性鹽過多不僅耗費(fèi)有機(jī)溶劑,可能導(dǎo)致沉淀不好。沉淀的條件一經(jīng)確定,就必須嚴(yán)格控制,才能得到可重復(fù)的結(jié)果。醫(yī)學(xué)教育`網(wǎng)搜集整
3、理有機(jī)溶劑濃度通常以有機(jī)溶劑和水容積比或用百分濃度表示。有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)分辨力比鹽析法好,溶劑易除去;缺點(diǎn)是易使酶和具有活性的蛋白質(zhì)變性。故操作時(shí)要求條件比鹽析嚴(yán)格。對(duì)于某些敏感的酶和蛋白質(zhì),使用有機(jī)溶劑沉淀尤其要小心??膳c水混合的有機(jī)溶劑,如酒精、甲醇、丙酮等,對(duì)水的親和力很大,能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜,在等電點(diǎn)時(shí)使蛋白質(zhì)沉淀。在常溫下,有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此,但若在低溫條件下,則變性進(jìn)行較緩慢,可
4、用于分離制備各種血漿蛋白質(zhì)。微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料,所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。對(duì)于微生物,應(yīng)注意它的生長(zhǎng)期,在微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,酶和核酸的含量較高,可以獲得高產(chǎn)量,以微生物為材料時(shí)有兩種情況:(1)得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等;(2)利用菌體含有的生化物質(zhì),如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼,脫脂并注意植物品種和生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同,其中所含生物大分子的量變化很大,另外與季節(jié)
5、性關(guān)系密切。對(duì)動(dòng)物組織,必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料,先進(jìn)行絞碎、脫脂等處理。另外,對(duì)預(yù)處理好的材料,若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn),應(yīng)冷凍保存,對(duì)于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。蛋白質(zhì)的分離純化一,蛋白質(zhì)(包括酶)的提取大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。(一)水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解
6、度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的15倍,提取時(shí)需要均勻的攪拌,以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面,多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利于溶解,縮短提取時(shí)間。但另一方面,溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活,因此,基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫(5度以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑(如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等)。下面著重討論提取液的pH值和
7、鹽濃度的選擇。1、pH值蛋白質(zhì),酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì),提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí),應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化,一般來(lái)說,堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。2、鹽濃度稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶,稱為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合,具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn),因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一
8、般以0.15摩爾升濃度為宜。緩沖液常采用0.020.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。(二)有機(jī)溶劑提取法一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶,不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越,一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng),特別是溶解磷脂的能力強(qiáng);二是丁醇兼具親水性,在溶
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