Iux標(biāo)記毒死蜱降解菌β菌株和土壤中定殖動態(tài)研究.pdf

1、本實驗從農(nóng)藥生產(chǎn)廢水的污泥中馴化、分離出一株能夠穩(wěn)定降解毒死蜱的菌株β菌株，通過菌落的形態(tài)特征和菌株16SrRNA分析，將該菌株鑒定為微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）。采用電轉(zhuǎn)化法將含發(fā)光酶基因luxAB的質(zhì)粒pTR102導(dǎo)入毒死蜱降解菌β菌株，將轉(zhuǎn)化子Lux-β分別釋放到不同處理的土壤中考察存活能力和對毒死蜱的降解效應(yīng)，為進一步構(gòu)建高效穩(wěn)定的基因工程菌提供參數(shù)。實驗結(jié)果如下。
　

2、　 1．經(jīng)分離和定向篩選，獲得3株具有降解毒死蜱能力的菌株，在相同的接菌量下，當(dāng)毒死蜱濃度為10mg·L－1時，72h的降解率分別為9.3％、17.7％、10.1％;96h對毒死蜱的降解率分別為15.7％、30.5％、14.0％。選擇降解率最高的β菌株作為進一步研究對象，在毒死蜱濃度為10mg·L－1，5mL降解體系中添加1g/L蛋白胨，500μL菌液時，能夠取得較好的降解效果，在48h，72h和96h的降解率分別為19.95％、34

3、.54％和44.52％。通過菌落的形態(tài)特征和菌株16SrRNA分析將β菌株鑒定為微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）。
　　 2．以培養(yǎng)3.5h左右，達到對數(shù)早期(OD600=0.5)的菌液制備感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒濃度16.5μg·mL－1，電壓2.5kV，電擊時間3ms時的轉(zhuǎn)化率最高，可達2.73×102個轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)化子Lux-β分別在抗生素平板和LB平板中傳代10次，

4、仍具有發(fā)光活性和對Km的抗性，說明質(zhì)粒pTR102在轉(zhuǎn)化子中可以穩(wěn)定遺傳。
　　 3．分別測定了轉(zhuǎn)化子Lux-β和β菌的最優(yōu)生長條件、生長曲線和對毒死蜱的降解率。Lux-β的最優(yōu)生長條件為pH=6.8，溫度30℃，而β菌株在pH=7.5，溫度35℃時生長最快；二者的生長趨勢沒有差異，0-3h為延滯期，3-12h為對數(shù)生長期，之后進入穩(wěn)定期和衰亡期；將培養(yǎng)了12h的轉(zhuǎn)化子Lux-β和β菌液取出，當(dāng)毒死蜱濃度為10mg·L－1時，L

5、ux-β在48h、72h、96h對毒死蜱的降解率分別為46.91％、59.9％、83.29％，而β菌在48h、72h、96h對毒死蜱的降解率分別為30.89％、25.36％、40.32％，轉(zhuǎn)化子對毒死蜱的降解能力比出發(fā)菌株提高了近一倍。
　　 4．設(shè)置了未滅菌土+毒死蜱20mg·kg－1+Lux-β，滅菌土+毒死蜱20mg·kg－1+Lux-β，未滅菌土+Lux-β，滅菌土+Lux-β，未滅菌土+毒死蜱20mg·kg－1，滅菌土

6、+毒死蜱20mg·kg－16個處理，考察了轉(zhuǎn)化子Lux-β在土壤中的競爭能力和毒死蜱的降解能力。結(jié)果表明，Lux-β在土壤中的數(shù)量變化規(guī)律是先上升后下降，但是在滅菌土壤中的下降趨勢較為緩慢，數(shù)量比較穩(wěn)定，在未滅菌土壤中下降的趨勢較快這說明土著微生物對外來微生物的生存影響較大，并且在加毒死蜱的處理組中Lux-β數(shù)量多于不加毒死蜱的處理組數(shù)量，說明Lux-β能夠以毒死蜱為營養(yǎng)物質(zhì)生存；未滅菌土+毒死蜱20mg·kg－1+Lux-β處理組中毒