毒死蜱高效降解菌Cupriavidus nantongensisX1中降解基因功能分析.pdf

1、毒死蜱是一種廣譜中等毒性的有機(jī)磷農(nóng)藥，被廣泛用作殺蟲劑、殺菌劑，除草劑，用于水果、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物的病蟲害防治。但是，它對(duì)哺乳動(dòng)物以及其它非靶標(biāo)生物也具有毒性。其降解產(chǎn)物3,5,6-三氯-2吡啶醇（TCP），不僅比毒死蜱的半衰期更長(zhǎng)，水溶性更高，而且會(huì)抑制其降解菌的降解活性。毒死蜱的大量和長(zhǎng)期使用，對(duì)水體、土壤等生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的殘留污染。本文以實(shí)驗(yàn)室保存的毒死蜱及TCP的高效降解菌株X1菌株（X1菌被鑒定為嗜銅菌屬下的一個(gè)新種，被國(guó)際

2、系統(tǒng)與進(jìn)化微生物學(xué)雜志收錄，命名為Cupriavidus nantongensis X1）作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了全基因組測(cè)序，得到了 X1菌的基因組完成圖，確定了降解過程中的關(guān)鍵基因，并對(duì) TCP代謝過程中的重要基因進(jìn)行了基因敲除。主要研究結(jié)果如下：
　　1.首次測(cè)定新種CupriavidusnantongensisX1的全基因組序列。使用Illiumie Hiseq與Miseq平臺(tái)，通過組裝、優(yōu)化和補(bǔ)洞后獲得了Cupriavi

3、dusnantongensisX1基因組完成圖。X1菌基因組由2條染色體 DNA序列與1條質(zhì)粒序列組成，全長(zhǎng)7,136,420bp，共有6524個(gè)編碼基因，57個(gè)tRNAs，15個(gè)rRNAs，GC含量66.72％。序列提交Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)，所獲登錄號(hào)為：CP014844，CP014845，CP014846。
　　2.通過與GO、KEGG、COG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，獲得X1菌編碼基因以及對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物的功能注釋。并通過組裝序列、編碼

4、基因、ncRNA信息、COG、KEGG、GO功能注釋，繪制得到了X1菌基因組圈圖。
　　3.通過與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定毒死蜱在X1菌降解的關(guān)鍵基因--OPH基因，和毒死蜱高毒降解產(chǎn)物3,5,6-三氯-2-吡啶醇（TCP）在X1菌中降解的關(guān)鍵基因—TcpA基因，首次確定TCP降解的完整降解基因簇。結(jié)果分析顯示：OPH基因位于質(zhì)粒上，編碼有機(jī)磷水解酶，催化毒死蜱降解過程中的第一步反應(yīng)，將毒死蜱水解為 TCP與TCMP；降解

5、TCP的關(guān)鍵基因TcpA基因位于1號(hào)染色體上，編碼2,4,6-三氯苯酚單加氧酶催化TCP降解過程中的氧化脫氯過程。
　　4.分析得到毒死蜱在X1菌中的代謝路徑。毒死蜱在OPH基因作用下降解為TCP與TCMP，TCP經(jīng)過分步氧化脫氯后形成3,6-二羥基吡啶-2,5-二酮，經(jīng)過脫乙?；复蜷_吡啶環(huán)，在馬來(lái)酰醋酸還原酶作用下生成β-酮己二酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終代謝成為二氧化碳和水。
　　5.通過研究確定X1菌對(duì)氨芐青霉素，卡那霉

6、素，氯霉素，鏈霉素，四環(huán)素，慶大霉素，紅霉素等7種抗生素的抗性譜。利用梯度平板，測(cè)定氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素、慶大霉素對(duì) X1菌株的 MIC值分別為20.67μg/ml、12.47μg/ml、2.35μg/ml、4.02μg/ml、2.82μg/ml。X1菌株對(duì)50μg/ml卡那霉素不敏感，對(duì)100μg/ml紅霉素不敏感。
　　6.利用同源重組對(duì) X1菌中 TcpA基因進(jìn)行單交換插入失活。通過自殺質(zhì)粒PJQ200SK（慶