普通生物化學實驗

1、生物化學基礎(chǔ)實驗教學課件,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,生化與分子生物學實驗室 于樂軍,目錄,實驗一 生物化學實驗技能培訓 實驗二 蛋白質(zhì)部分性質(zhì)實驗 實驗三 Folin-wu法定量測定血糖的含量 實驗四 Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)濃度 實驗五 氨基酸的紙層析 實驗六 醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白 實驗七 胰蛋白酶的活力測定 實驗八

2、酵母RNA的提取及鑒定 實驗九 DNA的定量測定 實驗十 水果中維生素C的定量測定 實驗十一 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳牛血清,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,生物化學實驗技能培訓,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,通過生物化學實驗應該做到：,⑴ 學習設(shè)計一個實驗的基本思路，掌握各個實驗的基本原理，學會嚴密地組織自己的實驗，合理地安排實驗步驟和時間。⑵ 訓練實

3、驗的動手能力，學會熟練地使用各種生物化學實驗儀器。⑶ 學會準確翔實地記錄實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能，提高實驗報告的寫作能力，能夠整齊清潔地進行所有的實驗，培養(yǎng)嚴謹細致的科學作風。⑷ 掌握生物化學的各種基本實驗方法和實驗技術(shù)，為今后參加科研工作打下堅實的基礎(chǔ)。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,實驗室規(guī)則,⑴ 實驗前必須認真預習實驗內(nèi)容，明確本次實驗的目的和要求，掌握實驗原理。⑵ 實驗時自覺遵守實驗室紀律，保持室內(nèi)安

4、靜，不大聲說笑和喧嘩。⑶ 實驗過程中要聽從教師指導，認真按照實驗步驟和操作規(guī)程進行實驗。若想改進和設(shè)計新的實驗方法，必須取得教師的同意。實驗時認真進行實驗記錄，實驗完畢及時整理數(shù)據(jù)，按時上交實驗報告。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,⑷ 實驗臺面、稱量臺、藥品架、水池以及各種實驗儀器內(nèi)外都必須保持清潔整齊，藥品稱完后立即蓋好瓶蓋放回藥品架，嚴禁瓶蓋及藥勺混雜，切勿使藥品（尤其是NaOH）灑落在天平和實驗臺面上，

5、毛刷用后必須立即掛好，各種器皿不得丟棄在水池內(nèi)。 ⑸ 配制試劑按實驗實際使用量配制，多余的重要試劑和各種有機試劑要按教師要求進行回收；昂貴試劑需要回收，不得丟棄。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,⑹ 配制的試劑和實驗過程中的樣品，尤其是保存在冰箱和冷室中的樣品，必須貼上標簽、寫上品名、濃度、姓名和日期等，放在冰箱中的易揮發(fā)溶液和酸性溶液，必須嚴密封口。⑺ 強酸強堿以及其他實驗廢液必須倒入廢液桶。電泳后的凝膠和

6、各種廢物不得倒入水池，只能倒入廢物桶。⑻ 使用貴重精密儀器應嚴格遵守操作規(guī)程。使用分光光度計時不得將溶液灑在儀器內(nèi)外和地面上。儀器發(fā)生故障應立即報告教師，未經(jīng)許可不得自己隨意檢修。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,⑼ 實驗室內(nèi)嚴禁吸煙、飲水和進食， 嚴禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液體不得接近明火和電爐，凡產(chǎn)生煙霧、有害氣體和不良氣味的實驗，均應在通風條件下進行。⑽ 實驗完畢必須及時洗凈并放好各種玻璃儀器，插好

7、自動部分收集器上的試管，保持實驗臺面和實驗柜內(nèi)的整潔。⑾ 嚴禁抄拿他組儀器，不得將器皿遺棄在分光光度計內(nèi)和其他實驗臺面上，打破了玻璃儀器要及時向教師報告，并自覺登記，學期結(jié)束時按規(guī)定進行處理。⒀ 每日實驗完畢，值日生要認真做好實驗室的衛(wèi)生值日工作。最后離開實驗室的實驗人員，必須檢查并關(guān)好水、電、門、窗。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,蛋白質(zhì)部分性質(zhì)實驗

8、 —蛋白質(zhì)顏色反應和沉淀反應,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,蛋白質(zhì)分子中某種或某些集團可與顯色劑作用，產(chǎn)生顏色。不同的蛋白質(zhì)由于所含的氨基酸不完全相同，顏色反應亦不完全相同。顏色反應不是蛋白質(zhì)的專一反應，一些非蛋白物質(zhì)也可產(chǎn)生同樣的顏色反應，因此不能根據(jù)顏色反應的結(jié)果來決定被測物是否為蛋白質(zhì)。另外，顏色反應也可作為一些常用蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。,第一部分 蛋白

9、質(zhì)的顏色反應,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,一、試驗原理,二、實驗儀器1、吸管 2、滴管 3、試管 4、電爐 5、pH試紙 6、水浴鍋三、實驗試劑1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，3-4層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸餾水稀釋至200ml。3、Millon’s試劑：40g汞溶于60ml濃硝酸（水浴加溫助溶）溶解后，冷卻，加二倍體積的蒸餾水，混

10、勻，取上清夜備用。此試劑可長期保存。4、1%CuSO4：1g CuSO4晶體溶于蒸餾水，稀釋至100ml5、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸餾水，稀釋至100ml6、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀釋至100ml.7、尿素晶體 8、濃硝酸 9、冰醋酸 10、濃硫酸,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,（一）米倫（Millon’s）反應原理：米倫試劑是硝

11、酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物。他能與苯酚及某些二羥基苯衍生物起顏色反應。組成蛋白質(zhì)的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基團，因此該反應為蛋白質(zhì)中酪氨酸存在的依據(jù)。操作：1、苯酚實驗：取0.5%苯酚溶液1ml于試管中，加Millon’s試劑0.5ml，于電爐上小心加熱，溶液即出現(xiàn)玫瑰紅色。2、蛋白質(zhì)實驗：取2ml蛋白液，加Millon’s試劑0.5ml，出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)沉淀，小心加熱，凝固的蛋白質(zhì)出現(xiàn)紅色。,中國海洋大

12、學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,四、實驗步驟,（二）雙縮脲反應原理：尿素被加熱，則兩分子的尿素放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合成紫色的化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵與縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能進行此反應。雙縮脲反應可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。 操作：1、尿素實驗取少量尿素晶體放在干燥的試管中，微火加熱使其熔化成液體，此時有氨氣放出，可用濕潤的試紙檢驗，至液體重新

13、結(jié)晶出現(xiàn)白色固體時，停止加熱，冷卻。然后加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察有無紫色出現(xiàn)。2、蛋白液實驗取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察有無紫色出現(xiàn)。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,（三）黃色反應原理：蛋白質(zhì)分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于濃硝酸可反應并生成黃色物質(zhì)，此物質(zhì)

14、在堿性環(huán)境下變?yōu)榻埸S色的硝基苯衍生物硝醌酸等。操作：取一支試管，加入1ml蛋白液及濃硝酸5滴。加熱，冷卻后注意顏色變化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，顏色有什么變化？,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,（四）茚三酮反應原理：蛋白質(zhì)與茚三酮共熱，產(chǎn)生蘭紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應為一切蛋白質(zhì)及a-氨基酸所共有。亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應呈黃色，含有氨基的其他物質(zhì)亦呈此

15、反應。操作：取蛋白液1ml于試管中，加4-8滴茚三酮溶液，加熱至沸，即有藍紫色出現(xiàn)。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,第二部分 蛋白質(zhì)的沉淀反應,一、試驗原理蛋白質(zhì)是親水性膠體，在溶液中的穩(wěn)定性與質(zhì)點大小、電荷、水化作用有關(guān)，但其穩(wěn)定性是有條件的，相對的。如果條件發(fā)生了變化，破壞了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀出來。,蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶電荷。當破壞這兩個因素時，蛋白質(zhì)中從溶液中

16、析出而產(chǎn)生沉淀。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,二、實驗儀器1、移液管 2、吸管 3、試管 4、電爐三、實驗試劑1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，3-4層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。2、飽和硫酸銨溶液：100ml蒸餾水中加硫酸銨至飽和。3、硫酸銨晶體：用研缽研成碎末。4、95%乙醇。5、醋酸鉛溶液：1g醋酸鉛溶于蒸餾水并稀釋至100ml6、硫酸銅溶液：1g CuSO4晶

17、體溶于蒸餾水，稀釋至100ml7、氯化鈉晶體8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸餾水中并稀釋至100ml9、飽和苦味酸溶液：100ml蒸餾水中加苦味酸至飽和。10、1%醋酸溶液。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,四、實驗步驟（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用原理：向蛋白質(zhì)中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)膠體顆粒脫水，破壞其水化層，同時它所帶有的電荷亦被中性鹽上所帶的相反電荷的離子所

18、中和。于是穩(wěn)定因素被破壞，蛋白質(zhì)聚集沉淀。鹽析作用一般不使蛋白質(zhì)變性。操作：1、取試管1支，加蛋白液2ml，然后加固體硫酸銨(加的過程要緩慢，加的量要少隨時搖勻），直至其飽和（大約為50%）。搖勻靜置數(shù)分鐘，則有球蛋白析出。 2、將上述混合液過濾。向濾液中逐漸加入少量固體硫酸銨（每次加入量約為米粒大?。?，邊加邊搖，直至飽和為止，此時析出為清蛋白。再加入少量蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分

19、子生物學實驗室,（二）有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)原理：某些有機溶劑（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝聚而沉淀。操作：取一試管加蛋白液1ml，，加入晶體氯化鈉少許，待溶解后再加95%乙醇3ml,搖勻，觀察現(xiàn)象。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,（三）重金屬鹽與某些有機酸沉淀蛋白質(zhì)原理：重金屬離子（如Pb2+、Cu2+等）與蛋白質(zhì)的羧基等結(jié)

20、合生成不溶性的金屬鹽類而沉淀，同時蛋白質(zhì)發(fā)生變性。某些有機酸的酸根則與蛋白質(zhì)的自由氨基結(jié)合而沉淀。 操作：1、取試管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸鉛溶液，另一支管中滴加1%硫酸銅溶液，至有沉淀產(chǎn)生。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,（四）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)原理：植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物成為生物堿。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應的物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸等。當溶液PH小于等

21、電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑的負離子發(fā)生反應而沉淀。操作：取2支試管，分別加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加飽和苦味酸和鞣酸數(shù)滴，觀察現(xiàn)象。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,（一）   米倫（Millon’s）反應1、苯酚實驗：取0.5%苯酚溶液1ml于試管中，加Millon’s試劑0.5ml，電爐小心加熱觀察顏色變化。2、蛋白質(zhì)實驗：取2ml蛋白液，加Millon’s

22、試劑0.5ml，出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)沉淀，小心加熱，觀察現(xiàn)象。（二）   雙縮脲反應1、取少量尿素晶體放在干燥的試管中，微火加熱熔化，至重新結(jié)晶時冷卻。然后加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察現(xiàn)象。 2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察現(xiàn)象。（三）   黃色反應 取一支試管，加入1m

23、l蛋白液及濃硝酸5滴。加熱，冷卻后注意顏色變化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，顏色有什么變化？（四）   茚三酮反應 取蛋白液1ml于試管中，加10滴茚三酮溶液，加熱至沸，即有藍紫色出現(xiàn)。,,（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用1、取試管1支，加蛋白液2ml，然后加固體硫酸銨(加的過程要緩慢，加的量要少，隨時搖勻），直至其飽和（大約為50%）。搖勻靜置數(shù)分鐘，則有球蛋白析出。 2、將上述混合液過濾。向濾液中逐漸加

24、入少量固體硫酸銨，直至飽和為止，此時析出為清蛋白。再加入少量蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。（二）有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)試管中加蛋白液1ml，加晶體氯化鈉少許，溶解后加95%乙醇3ml,搖勻，觀察現(xiàn)象。（三）重金屬鹽與某些有機酸沉淀蛋白質(zhì)1、取試管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸鉛溶液，另一支管中滴加1%硫酸銅溶液，至有沉淀產(chǎn)生。2、取一支試管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混勻，觀察結(jié)果。（四）生物堿試劑

25、沉淀蛋白質(zhì)取一支試管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加飽和苦味酸數(shù)滴，觀察現(xiàn)象。,蛋白質(zhì)的顏色反應,蛋白質(zhì)的沉淀,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,http://222.195.234.199/openclass登錄名：自己的學號密碼：自己的學號大家先把電子版的實驗報告作好，然后在周五或周六以后再上傳文件實驗報告要求：1目的2原理3實驗儀器4實驗試劑5實驗步驟6實驗結(jié)果7實驗分析下次實驗：血糖的定

26、量測定-folin-wu法,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,Folin-Wu法定量測定血糖的含量,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,,1.氧化供能 2.人體的主要組成成分之一 糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；轉(zhuǎn)化成脂肪和某些非必需氨基酸等3.糖代謝紊亂→供能障礙→一系列代謝變化,,糖的重要生理功能：,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,血糖及血糖水平的概念：

27、,血糖：指血液中的單糖：葡萄糖,血糖水平：血漿中葡萄糖濃度,血糖總維持在恒定水平：3.9∽6.7mmol/L,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,,血糖的來源和去路,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,血糖測定的目的和意義,臨床：血糖檢測是目前診斷糖代謝異常相關(guān)疾病的主要依據(jù)?？蒲校涸诖x疾病的研究中，常測定血糖。在某些藥物的研究中，也涉及血糖的測定。,調(diào)節(jié)血糖水平的激素：胰島素、胰高血糖素、

28、糖皮質(zhì)激素和腎上腺素。血糖水平異常：⑴高血糖及糖尿病；⑵低血糖,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,高血糖癥：指空腹血糖濃度超過7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，臨床上最常見的病理性高血糖癥是糖尿病?！√悄虿。菏且环N慢性、復雜的代謝紊亂性疾病,系胰島素絕對不足或相對不足，以高血糖癥為基本生化特點。同時伴有糖、脂類、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂，甚至出現(xiàn)一系列并發(fā)癥如眼、腎的微血管病變及神經(jīng)病變等。,

29、,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,癥狀＋隨機血漿葡萄糖≥ 11.1mmol/L,或空腹血漿葡萄糖≥ 7.0mmol/L。癥狀不典型者需另一天再次證實。隨機血糖是指一天中的任一時間采血測得的血糖濃度。糖尿病典型的癥狀是“三多一少”，即多飲、多尿、多食及消瘦,,糖尿病的診斷標準,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,,血糖的測定方法,測定方法,酶法：（1）己糖激酶法（HK）　　?。?）

30、葡萄糖氧化酶法（GOD法）特異性高，靈敏度高，干擾因素少，適用于自動化分析，為葡萄糖測定的參考方法，但是試劑較貴,,無機化學法： Folin-Wu法，特異性差,有機化學法：鄰甲苯胺法、聯(lián)苯胺法、氨基聯(lián)苯法　　　　　　干擾因素多,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,掌握Folin－Wu法測定血糖含量的原理和方法。學會制備無蛋白血濾液。掌握7200型可見分光光度計的使用方法。,一、目的要求,中國海洋大學生物基礎(chǔ)

31、實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,二、實驗原理,葡萄糖是一種多羥基的醛類化合物。其醛基具有還原性，與堿性銅試劑混合加熱，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，Cu2+即被葡萄糖還原成Cu+（Cu2O）而沉淀。 Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+ （Cu2O）無蛋白血濾液中的葡萄糖和酸性鉬酸鹽溶液共熱反應, Cu2O又把酸性鉬酸試劑（Mo6+）還原成低價的藍色鉬化合物—鉬藍 。Cu2O+酸性鉬酸試劑 藍色鉬

32、化合物 OD420比色 血濾液中葡萄糖的含量與產(chǎn)生的Cu2O成正比，而Cu2O的量與產(chǎn)生的鉬化合物的量成正比。可用比色法定量的測定。,,,,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,三、實驗儀器,1、25mL血糖管×3支；2、血糖管橡膠塞×3個；3、沸水浴小鍋×1個； 4、100mL錐形瓶×2個；5、電爐×1個；6、濾紙×1

33、盒；7、吸耳球×2個； 8、7200型分光光度計×1臺;,血糖管,7200型分光光度計,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,1、標準葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：稱取1.000g葡萄糖，溶于蒸餾水，稀釋并定容至100ml。(2)葡萄糖標準液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸餾水定容。2、10%鎢酸鈉溶液：稱取鎢酸鈉10g，溶于

34、蒸餾水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸餾水中加入1ml的濃硫酸。4、堿性硫酸銅溶液 A液：無水碳酸鈉35g，酒石酸鈉13g及碳酸氫鈉11g溶于蒸餾水，稀釋定容至1000ml. B液：硫酸銅晶體5g，溶于蒸餾水并定容至100ml。 臨用時，A液：B液=9：1混合（體積比），混合液于冰箱中保存（4℃）。,四、實驗試劑,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,5、酸性鉬酸鹽

35、溶液：稱取鉬酸鈉600g,用少量蒸餾水溶解后傾入2000ml 的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，傾入另一較大的試劑瓶中，加溴水0.5ml，搖勻，靜止數(shù)小時后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，邊加邊搖勻，再加25%硫酸150ml。置暗處次日，用空氣將剩余的溴趕去。然后加99%醋酸75ml，搖勻，用蒸餾水稀釋定容至1000ml,貯于棕色瓶中。,四、實驗試劑,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分

36、子生物學實驗室,1、無蛋白血濾液的制備：用5ml移液管吸取全血（已加抗凝劑）1ml,緩緩放入100ml錐形瓶中，加蒸餾水7ml，搖勻，溶血后（血液變?yōu)榧t色透明）加10%鎢酸鈉1ml，搖勻.。再加0.33mol/L H2SO41ml，邊加邊搖，加畢充分搖勻，放置5～15分鐘，至沉淀變?yōu)榘底厣ㄈ绮蛔兩稍偌?.33mol/L H2SO41-2滴）。用干濾紙過濾。先傾入少許，待濾紙濕潤后在全部倒入，如濾液不清需重新過濾。每毫升無蛋白血

37、濾液相當于1/10ml全血。,五、實驗步驟,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,2、血糖的定量測定：取25ml的血糖管3支，編號。第一支血糖管中加入2ml蒸餾水（空白管）；第二支血糖管中加2ml標準葡萄糖液；用吸管吸取無蛋白血濾液2ml，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的堿性硫酸銅溶液，同時置于沸水浴中8分鐘，取出，在流水中迅速冷卻后,勿搖動，各加4ml酸性鉬酸鹽溶液。一分鐘后，用蒸餾水

38、稀釋至25ml，混勻，用7200分光光度計在420nm波長處比色，以空白管調(diào)節(jié)零點。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,按下式計算100ml全血中所含血糖的含量m=A1/A0×C0÷0.1×100式中: m=100ml全血中含血糖毫克數(shù) ; C0=標準液葡萄糖含量（0.1mg/ml）；A1=樣品液光吸收值 ; A0=標準液光吸收值 0.1：1ml無蛋白血溶液相對于0.1ml全血

39、,六、結(jié)果計算：,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,注意事項：1.加硫酸、鎢酸鈉時，要邊加邊搖勻2.沉淀由鮮紅變?yōu)榘底厣且蜴u酸鈉與硫酸生成鎢酸，在適當酸度時，使血紅蛋白變性沉淀，如果沉淀不變暗棕色或重新過濾后仍混濁，是因為血液中所加抗凝劑過多，可以加入10％硫酸1-2滴，待暗棕色后再過濾。3.用定量濾紙過濾后應該得到完全澄清無色之無蛋白血濾液?！∪绻玫饺詭в屑t色的血濾液則說明蛋白質(zhì)未被完全去除。,中國

40、海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,【思考題】,1、實驗過程中那些操作可能影響實驗結(jié)果的準確性？2、實驗中，血糖管有什么作用？3、實驗過程中，為什么要用流水冷卻加入堿性硫酸銅液反應后的血糖管？,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,五、實驗步驟,1、無蛋白血濾液的制備：,,蒸餾水7ml,搖勻,10%鎢酸鈉1ml,,搖勻,0.33mol/L H2SO41ml,,邊加邊搖,加畢充分搖勻,放置5—15分(

41、沉淀變?yōu)榘底厣?(如不變色,再加0.33mol/L H2SO41~2滴 ),干濾紙過濾,無蛋白血濾液(每毫升相當于1/10ml全血),20ml錐形瓶,溶血(變?yōu)榧t色透明),,用5ml移液管取全血1ml（已加抗凝劑,,,2、血糖的定量測定：,,,m=OD1/OD2× C× 10× 100,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,分光光度計的工作原理,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分

42、子生物學實驗室,朗伯-比爾定律,朗伯定律：A=k1L 比爾定律：A=k2C朗伯-比爾定律：如同時考慮液層厚度和溶液濃度對吸光度的影響，則吸光度與溶質(zhì)的濃度和溶液的厚度的乘積成正比。 A=KLC,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,朗伯-比爾定律應用,A標=KC標LA樣=KC樣L,,標準品法測定未知樣品含量,,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,72

43、00型分光光度計的操作程序,連接儀器電源線，確定儀器供電電源有良好的接地性能。接通電源，使儀器預熱20分鐘。用鍵設(shè)置測試方式：投射比（T），吸光度（A），已知標準樣品濃度值方式（C）和已知標準樣品斜率（F）方式。用波長選擇旋鈕設(shè)置您所需的分析波長。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,將參比樣品溶液和被測樣品溶液分別倒入比色皿中，打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋。一般情況下，參比

44、樣品放在第二個槽位中。將0％T校具（黑體）置入光路中，在T方式下按“0％T”鍵，此時顯示器顯示“000.0”,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,按 MODE鍵選擇A模式將參比樣品拉入光路中，按“0A/100％T”鍵調(diào)0A/100％T，此時顯示器顯示的“BLA”直至顯示“0.000”A為止。當儀器顯示器顯示出“0.000”A后，將被測樣品推入光路，這時，您便可從顯示器上得到被測樣品的吸光度。,中國海洋大學生物基

45、礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,,,分光光度計的使用注意事項:,比色皿的清潔程度，直接影響實驗結(jié)果。因此，特別要將比色皿清洗干凈。裝樣前處理：自來水反復沖洗→蒸餾水漂洗2次→待裝溶液漂洗2次。用完后用自來水和蒸餾水洗凈并用檫鏡紙檫干放回比色皿盒中。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,,,拿

46、放比色皿時，應持其“毛面”，不要接觸“光面”。,,若比色皿外表面有液體，應用擦鏡紙朝同一方向拭干，以保證吸光度測量不受影響。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,,,比色皿內(nèi)盛液應為其容量的2/3，過少會影響實驗結(jié)果，過多易在測量過程中外溢，污染儀器。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,福林(Folin)-酚試劑法測定蛋白質(zhì)的濃度,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,蛋

47、白質(zhì)的定量分析是生物化學和其它生命學科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復情況的重要指標，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測的重要指標。在生化實驗中，對樣品中的蛋白質(zhì)進行準確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進行的一項非常重要的工作。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法代來了

48、許多具體的困難。目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測定方法：物理性質(zhì)：紫外分光光度法化學性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry 法， BCA法，膠體金法染色性質(zhì)：考馬氏亮藍染色法、銀染法其他性質(zhì)：熒光法,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,蛋白質(zhì)不同方法比較,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,一、實驗原理,蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基

49、酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍色（生成鉬藍和鎢藍化合物）。藍色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可用比色法測定。此法的特點是靈敏度高，較雙縮脲高兩個數(shù)量級，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應約在15分鐘有最大顯色，并最少可穩(wěn)定幾個小時，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質(zhì)都會影響測定結(jié)果的準確性。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,二、實驗儀器1.卵清蛋白片

50、2.7200分光光度計3.試管 4.移液管三、實驗試劑1.Folin-酚試劑A：堿性銅溶液 甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氫氧化鈉溶液中 乙液：取CuSO4.5H2O晶體0.5g，溶于1%酒石酸鉀100ml中。臨用時按甲：乙=50：1混合使用。2.Folin-酚試劑B：將100g鎢酸鈉、25g鉬酸鈉、700ml蒸餾水、50ml85%磷酸繼10

51、0ml濃鹽酸置于1500ml的磨口圓底燒瓶中，充分混勻后，接上磨口冷凝管，回餾10小時，再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50ml及液溴數(shù)滴，開口煮沸15分鐘，在通風櫥內(nèi)驅(qū)除過量的溴。冷卻，稀釋至1000ml，過濾，濾液成微綠色，貯于棕色瓶中。臨用時，用1mol/l的氫氧化鈉溶液滴定，用酚酞作指示劑，根據(jù)滴定結(jié)果，將試劑稀釋至相當于1mol/L的酸。3.1mg/mL牛血清蛋白液：稱取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化鈉溶液中，并稀釋至 10

52、00ml,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,四、實驗步驟,1.標準曲線的繪制 取7支干燥的試管，編號，按下表加入試劑，比色后，以光密度為縱坐標，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標作圖。2.樣品測定 準確吸取樣液0.5ml于干燥的試管中，同樣按下表加入試劑，測出光密度值后，對照標準曲線求出樣液的蛋白質(zhì)濃度。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生

53、物學實驗室,【注意事項】,1、Tris緩沖液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚類、檸檬酸以及高濃度的尿素、胍、硫酸鈉、三氯乙酸、乙醇、丙酮……等均會干擾Folin-酚反應。2、當酚試劑加入后，應迅速搖勻（加—管搖一管）以免出現(xiàn)渾濁。3、由于這種呈色化合物組成尚未確立，它在可見光紅外光區(qū)呈現(xiàn)較寬吸收峰區(qū)。不同實驗室選用不同波長，有選用500或 540nm，有選用640nm，700或750nm。選用較高波長，樣品呈現(xiàn)較大的光吸收，本實驗選用波長

54、640nm。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,【思考題】,蛋白質(zhì)含量測定的方法有哪些，各有什么優(yōu)缺點？哪些因素可干擾福林(Folin)-酚試劑法測定蛋白？結(jié)合實驗經(jīng)歷，談?wù)効梢詮哪男┓矫媸箤嶒灲Y(jié)果更準確？,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,附：標準曲線EXCEL表制作：,1、將濃度和所測OD值輸入到EXCEL表中。2、將數(shù)據(jù)區(qū)域全部選中。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物

55、學實驗室,3、點擊“圖表向?qū)А辨I。,4、在圖標類型中選擇“XY散點圖”，然后點擊第一個圖。,,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,5.點擊“下一步”。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,6、在“圖表選項”的“標題”中，于選中的紅色區(qū)域內(nèi)可以填入相應的名稱。然后點擊“完成”。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,7、鼠標點住數(shù)值點，右鍵單擊，選擇”添加趨勢線”,中國海洋大學生物

56、基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,8、在“添加趨勢線”對話框中選擇“線性”分析類型，然后點“確定”。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,9、點住直線右鍵單擊，點“趨勢線格式”，對標準曲線進行編輯。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,10、在“選項”中勾選“顯示公式”和“顯示R平方值”兩項，點“確定”,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,,11、曲線上會顯示出此標準曲

57、線的回歸方程和R2，將樣品測得的OD值（即Y值）代入方程，就得出樣品的濃度（即X值）。 這里的R2表示標準曲線的線性，即R2越接近于1，你所測的數(shù)值越準確，也越具有說服力。一般要求至少R2=0.99以上為好。,,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,氨基酸的紙層析,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,層析技術(shù)介紹,一、定義層析技術(shù)(chromatography）也稱色譜技術(shù)，是一種利用

58、混合物中諸組分在兩相間的分配原理以獲得分離的方法。具體的說是根據(jù)被分離的混合物中各組分的理化性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中進行分配以獲得分離的方法。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅

59、膠或纖維素上的溶液）。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,二、層析技術(shù)的原理,層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固定相，另一是流動相。當待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組分的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶

60、解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量比）不同，且隨流動相向前移動，各組分不斷地在兩相中進行再分配。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到將各組分分離的目的。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,三、發(fā)展簡史,層析分離技術(shù)在20世紀初就已得到應用：1903年用于植物色素的分離,各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”1931年用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異

61、構(gòu)體；1944年出現(xiàn)了以濾紙作為支持物的紙層析；20世紀六十年代末出現(xiàn)了高效液相色譜(HPLC)。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,四、層析技術(shù)的種類,◆按層析的機理劃分：　　吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。　吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。　分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。　離子交換層析：利

62、用不同組分對離子交換劑親和力的不同?！∧z層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,◆按流動相與固定相的不同劃分：　　氣相層析、液相層析。這兩大類層析是以流動相不同來劃分的。如同時區(qū)分流動相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。◆按操作形式劃分：　　柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等?！〖垖游觯河脼V紙做液體的載體，點樣后

63、，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。　薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,一、實驗目的,1、通過氨基酸的分離，學習并掌握紙層析的原理和操作技術(shù)； 2、掌握分配層析法； 3、掌握影響分配系數(shù)的因素。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,二、實驗原理,紙層析法：是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。 濾紙纖

64、維上羥基具有親水性，因此吸附水作為固定相，通常把有機溶劑作為流動相。 將樣品點在濾紙上，進行展層，樣品中的各種氨基酸在兩相溶劑中不斷進行分配。由于它們的分配系數(shù)不同，不同氨基酸隨流動相移動的速率就不同，于是就將這些氨基酸分離開來，形成距原點不等的層析點。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,分配層析法：利用物質(zhì)在兩種或兩種以上不同的混合溶劑中的分配系數(shù)不同，而達到分離目的的一種實驗方法。在一定條件下，

65、一種物質(zhì)在某種溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)α是一個常數(shù)。,溶質(zhì)在固定相的濃度(Cs)分配系數(shù)α= 溶質(zhì)在流動相的濃度（Cl),,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,溶劑系統(tǒng)：正丁醇：甲酸：水=15：3：2 固定相：水和濾紙纖維素有較強的親和力，因而其擴散作用降低形成固定相; 流動相：有機溶劑和濾紙親和力弱，所以在濾紙毛細管中自由流動，形成流動相。 由于混合液中各種氨基酸的α值不同，所以

66、移動速率（即遷移率Rf值）就不同，從而達到分離的目的。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,移動速率(比移值)： 原點到層析點中心的距離 Rf = 原點到溶劑前沿的距離,,,,,,,,,,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,影響Rf值的主要因素： Rf決定于被分離物質(zhì)在兩

67、相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比。由于在同一實驗條件下，兩相體積比是一常數(shù)，所以主要決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)分配系數(shù)不同，Rf也就不同。（1）物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性： 物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同極性不同，在兩相中的溶解度也就不同，物質(zhì)的極性決定了物質(zhì)在水和有機溶劑之間的分配系數(shù)，極性大的易溶于水中即固定相中，Rf?。环粗?Rf則較大。,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,（2）層析溶劑： 首先，溶劑的純度要高

68、。 其次，溶劑系統(tǒng)選擇應考慮被分離的物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的Rf在0.05～0.85。 再次，溶劑系統(tǒng)必須新鮮配制，如正丁醇- 甲酸-水系統(tǒng)久放易引起酯化。 （3）pH值： 溶劑、濾紙和樣品的pH值都會影響物質(zhì)的解離，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使Rf改變；,中國海洋大學生物基礎(chǔ)實驗教學中心生化與分子生物學實驗室,（4）濾紙： 層析濾紙由高純度棉花制成，要求濾紙要清潔，質(zhì)地均一，厚薄一致，