k-ras野生型大腸癌發(fā)生與mapk•jnk的關(guān)系

1、二、立論依據(jù)二、立論依據(jù)（包括項(xiàng)目的研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻(xiàn)及出處）對基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢，論述項(xiàng)目的科學(xué)意義；對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿、圍繞國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展中的重要科技問題，論述其應(yīng)用前景。關(guān)于大腸癌的發(fā)生，長期以來認(rèn)為有兩種學(xué)說，即：adenomacarcinomasequence學(xué)說［１］(先有良性腺瘤，之后一部發(fā)生癌變)和denovo學(xué)說［２］(直接從正常粘膜發(fā)生癌變)。Vogels

2、tein于1988年對正常組織腺瘤癌組織進(jìn)行了詳細(xì)解析，完成了adenomacarcinomasequence(polypcarcinomasequence)的多階段發(fā)癌模型［１］，即：在小的腺瘤階段Cmyc發(fā)生異常，隨著腺瘤增大Kras基因出現(xiàn)點(diǎn)突變及P53，DCC等基因異常使腫瘤的一部分發(fā)生癌變。這一機(jī)制基本清楚。而denovo型發(fā)癌機(jī)制還不清楚。日本學(xué)者藤盛孝博教授(申請者的指導(dǎo)教授)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，在denovo型發(fā)癌

3、過程中，Kras基因基本不參與，此型癌的發(fā)生可能是由Kras以外的其他未知的癌基因參與所致。Ras基因作為人類大腸癌發(fā)癌的重要基因被廣泛研究?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，Kras基因的突變(Kras活性型)在人大腸癌的檢出率為4050%［4，5］，而其余5060%的不伴有Kras基因點(diǎn)突變(Kras野生型)大腸癌(其中一部為denovo型發(fā)癌者)的發(fā)生被認(rèn)為是由Kras基因以外的未知癌基因所致［３］。研究證明，Ras基因作為細(xì)胞增殖與分化的信號傳導(dǎo)啟動子

4、起重要作用。它的靶蛋白有Raf、MEKK及P23激酶等。其中，古典的MAPK(mitogenactivatedproteinkinase)信號傳導(dǎo)系(Ras→Raf1→MEK→MAPK)在細(xì)胞增殖，分化及發(fā)癌過程中起重要作用。它們具有傳導(dǎo)上位特異的激酶依次磷酸化和激活下位特異激酶的特性。即：Ras活性型激活Raf(MAPKKK)Raf激活MEK(MAPKK)，MEK激活MAPK。然后，由小分子的MAPK將信息轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，引起細(xì)胞核內(nèi)染

5、色體改變。因此，MAPK的活性可能在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的信號傳遞中起到一個(gè)連接作用［５］。新近的研究提示“MAPK的活性異?？赡芘c發(fā)癌有關(guān)［6，7］。一些纖維母細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，作為MAPK的新家族成員的JNK(cJunNterminalKinase)信號傳導(dǎo)系也受Ras活化的影響，可能參與Ras活性型細(xì)胞癌變［8。9］。近年的研究雖然提示MAPK，JNK參與了細(xì)胞癌變，但人大腸癌與KrasRaf1MEKMAPK以及與JNK傳導(dǎo)系間關(guān)系

6、尚不清楚［10。11。12，13，14］。尤其是Kras野生型及Kras活性型大腸癌與MAPK及JNK信號傳導(dǎo)系間關(guān)系方面的研究尚未見報(bào)道。倘若在大腸癌中(尤其在Kras野生型)發(fā)現(xiàn)有MAPK或JNK等蛋白激酶信號傳導(dǎo)異常(蛋白過表達(dá)，磷酸化或發(fā)現(xiàn)其點(diǎn)突變)，將會對闡明大腸癌的發(fā)生機(jī)制，特別是為探討Kras野生型大腸癌、denovo型癌發(fā)生機(jī)制提供有力依據(jù)。此乃本項(xiàng)目的主要意義所在。近來研究還表明大腸癌的Krascodon13點(diǎn)突變與大

7、腸癌預(yù)后有關(guān)［１5］。就是說Kras基因變異可能是判定大腸癌預(yù)后一個(gè)重要指標(biāo)。在我們最近的實(shí)驗(yàn)中，不論在大腸癌細(xì)胞株，還是在大腸癌組織內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了MAPK的活性。有趣的是，KrasCodon13有突變的大腸癌組織及細(xì)胞株內(nèi)MAPK活性均低于正常組織。這些都提示此類型大腸癌的癌變可能是通過不同于RasMAPK途徑的其它方式(JNK)發(fā)生的；與Kras有關(guān)的MAPK及JNK信號傳導(dǎo)蛋白激酶可能參與了大腸癌的發(fā)生，可能會對大腸癌的分期、病理類型

8、、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的判定提供分子生物學(xué)依據(jù)，對這些問題的探討也是本研究的目的和意義之一。－31－三、研究方案三、研究方案1.研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)：1)研究MAPK、JNK等信號傳導(dǎo)系蛋白激酶的活性與Kras野生型(KrasWT)及Kras活性型人類大腸癌發(fā)生的關(guān)系，探討人大腸癌發(fā)生機(jī)制；尤其要闡明Kras野生型大腸癌的發(fā)生機(jī)制，為研討denovo型大腸癌發(fā)生機(jī)制提供分子生物學(xué)依據(jù)。2)比較和探討MAPK、JNK等信號傳

9、導(dǎo)系蛋白激酶的活性及Kras的變異與大腸癌的臨床病理特征(病期、類型、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后)的相關(guān)關(guān)系，為臨床診療及預(yù)后判定提供分子生物學(xué)依據(jù)。研究內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)通過分子生物學(xué)手段將人大腸癌(組織及細(xì)胞株)分為Kras野生型和Kras活性型；用特異抗體(westernblot法)測定和比較兩型大腸癌的MAPK及JNK信號傳導(dǎo)系各蛋白激酶的活性，從而探討Kras及MAPKJNK信號傳導(dǎo)系與大腸癌發(fā)生及臨床病理特征的關(guān)系。一、人大腸癌的Kras基

10、因的分類(野生型和活性型)及分布的研究。二、測定Kras野生型及Kras活性型大腸癌的各自下位信號傳導(dǎo)蛋白激酶Raf1MEKMAPK等的活性水平。并比較這些蛋白激酶與此兩型(尤其是Kras野生型)大腸癌發(fā)生的相互關(guān)系。三、人大腸癌的KrasCodon12、13、61出現(xiàn)的點(diǎn)突變與MAPK等蛋白激酶活性間的關(guān)系。四、KrasCodon13有點(diǎn)突變的大腸癌與JNK信號傳導(dǎo)系蛋白激酶活性間的關(guān)系。五、比較上述諸蛋白激酶的活性、突變與人大腸癌不