土壤微生物量碳測定方法

1、1土壤微生物量碳測定方法及應用土壤微生物量碳測定方法及應用土壤微生物量碳（Soilmicrobialbiomass）不僅對土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分的循環(huán)起著主要作用，同時是一個重要活性養(yǎng)分庫，直接調(diào)控著土壤養(yǎng)分（如氮、磷和硫等）的保持和釋放及其植物有效性。近40年來，土壤微生物生物量的研究已成為土壤學研究熱點之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(MicrobialbiomasscarbonBc)來表示土壤微生物生物量的

2、大小。測定土壤微生物碳的主要方法為熏蒸培養(yǎng)法（FumigationincubationFI）和熏蒸提取法（FumigationextractionFE）。熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培養(yǎng)法測定土壤微生物量碳不僅需要較長的時間而且不適合于強酸性土壤、加入新鮮有機底物的土壤以及水田土壤。Voney(1983)發(fā)現(xiàn)熏蒸土壤用0.5molL1K2SO4提取液提取的碳量與生物微生物量有很好的相關(guān)性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法測定土壤

3、微生物碳的基本方法：該方法用0.5molL1K2SO4提取劑（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有機碳含量用重鉻酸鉀氧化法測定；以熏蒸與不熏蒸土壤提取的有機碳增加量除以轉(zhuǎn)換系數(shù)KEC(取值0.38)來計算土壤微生物碳。Wu等（1990）通過采用熏蒸培養(yǎng)法和熏蒸提取法比較研究，建立了熏蒸提取——碳自動一起法測定土壤微生物碳。該方法大幅度提高提取液中有機碳的測定速度和測定結(jié)果的準確度。林啟美等（1999）對熏蒸提取重鉻酸鉀氧化

4、法中提取液的水土比以及氧化劑進行了改進，以提高該方法的測定結(jié)果的重復性和準確性。對于熏蒸提取法測定土壤微生物生物碳的轉(zhuǎn)換系數(shù)KEC的取值，有很多研究進行了大量的研究。測定KEC值的實驗方法有：直接法（加入培養(yǎng)微生物、用14C底物標記土壤微生物）和間接法（與熏蒸培養(yǎng)法、顯微鏡觀測法、ATP法及底物誘導呼吸法比較）。提取液中有機碳的測定方法不同（如氧化法和儀器法），那么轉(zhuǎn)換系數(shù)KEC取值也不同，如采用氧化法和一起法KEC值分別為0.38（V

5、ance等，1987）和0.45（Wu等，1990）。不同類型土壤（表層）的KEC值有較大不同，其值變化為0.200.50（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dict等（1998）研究表明同一土壤剖面中不同濃度土層土壤的轉(zhuǎn)換系數(shù)KEC有較大的差異，從表層020cm土壤的KEC為0.41，逐步降低到180220cm土壤的KEC為0.31。一、基本原理熏蒸提取法測定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤時由于微

6、生物的細胞膜被氯仿破壞而殺死，微生物中部分組分成分特別是細胞質(zhì)在酶的作用下自溶和轉(zhuǎn)化為K2SO4溶液可提取成分（Joergensen1996）。采用重鉻酸鉀氧化法或碳自動分析儀器法測定提取液中的碳含量，以熏蒸與不熏蒸土壤中提取碳增量除以轉(zhuǎn)換系數(shù)KEC來估計土壤微生物碳。二、試劑配制（1）硫酸鉀提取劑（0.5molL1）：取871.25g分析純硫酸鉀溶解于蒸餾水中，定溶至10L。由于硫酸鉀較難溶解，配制時可用20L塑料桶密閉后置于苗床上（

7、60100revmin1）12小時即可完全溶解。（2）0.2molL1（16K2Cr2O7）標準溶液：稱取130℃烘23小時的K2Cr2O7（分析純）9.806g于1L大燒杯中，加去離子水使其溶解，定溶至1L。K2Cr2O7較難溶解，可加熱加快其溶解。（3）0.1000molL1（16K2Cr2O7）標準溶液：取經(jīng)130℃烘23小時的分析純重鉻酸鉀4.903g，用蒸餾水溶解并定溶至1L。3熏蒸過程需要24小時，因此通常在熏蒸時，將不熏蒸

8、土壤可置于4℃條件下保存。（3）土壤提取將除去氯仿后的熏蒸土壤轉(zhuǎn)移到125ml提取瓶中，與不熏蒸土壤同時采用50ml可調(diào)加液器加入100ml0.5molL1K2SO4提取液，水土比為1：4，并設3個試劑空白。如果采用重鉻酸鉀氧化法測定提取液中有機碳，也可采用2：；1的水土比，即加入50ml0.5molL1K2SO4提取液。在往復式振蕩器中振蕩（300revmin1）提取30分鐘，再用定量中速濾紙過濾于50ml塑料瓶中，貯藏于18℃冷凍柜

9、中，待測。經(jīng)貯藏的土壤提取液解凍后會有一些白色沉淀，據(jù)推測為CaSO4和4K2SO4，對提取液中有機碳的測定沒有影響，可以不必除去這些白色沉淀（Brookes等，1985）。（4）提取液中有機碳含量測定和土壤微生物碳計算：方法Ⅰ：重鉻酸鉀氧化法（林啟美等1999；Vance等1987）吸取10ml上述土壤提取液于經(jīng)過仔細檢查的150ml消化管（24295mm）中，加入5.0ml0.2molL1K2Cr2O7，5.0ml濃H2SO4溶液，

10、再加入少量經(jīng)濃硫酸處理的碎瓷片（3mm大小，防爆），混勻，置于1751℃磷酸浴中煮沸10分鐘，應注意消煮的時間應保證準確一致。冷卻后將溶液轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中，使總體積約為80ml，加入1滴鄰啡羅啉指示劑，用0.05molL1硫酸亞鐵標準溶液滴定消煮液中剩余的重鉻酸鉀，滴定過程為先由橙黃色變?yōu)樗{綠色，再變?yōu)樽丶t色，即到達終點。結(jié)果計算：提取的土壤有機碳（mgCkg1土）=[0.0124106M(V0V)f]W式中：M——為FeSO4

11、溶液濃度（molL1）；V0、V——分別為滴定空白和樣品消耗的FeSO4溶液體積（ml）；f——為稀釋倍數(shù)；W——為烘干土重（g）；0.012——為碳毫摩爾質(zhì)量（g）；106——為換算系數(shù)。土壤微生物碳：Bc=EcKc式中：Bc代表土壤微生物碳（mgCkg1）；Ec=熏蒸土壤提取的有機碳不熏蒸土壤提取的有機碳，單位mgCkg1；Kc為轉(zhuǎn)換系數(shù)，采用重鉻酸鉀氧化法取值0.38（Vance等，1987）。方法Ⅱ：碳自動分析儀器法（Wu等，1

12、990）取10ml土壤提取液于40ml樣品瓶中。加入10ml，5%六偏磷酸鈉溶液（pH2.0），使提取液中的沉淀（CaSO4和4K2SO4）全部溶解。再用直徑為2mm的細管向樣液中通過高純度氮氣（510分鐘），以除去溶解在樣液中的CO2，然后用Phoenix8000碳自動分析儀測定，待測提取液中的有機碳在硫酸鉀溶液作用下于紫外氧化室中氧化為CO2，該儀器可自動測定有機碳氧化放出的CO2量，通過工作曲線即可計算出提取液中的碳含量。工作曲線

13、制備：分別吸取0、0.5、1、2、3、4ml濃度為1000mgCL1鄰苯二甲酸鉀標準溶液溶于50ml容量瓶中，用高純度去離子水定容，即為0、10、20、40、60、80mgCL1系列標準碳溶液。分別取不同濃度的標準溶液10ml于樣品瓶中，加入10ml，5%的六偏磷酸鈉溶液（pH2.0），測定方法同土壤提取液樣品。結(jié)果計算：提取液有機碳含量（mgCkg1）=測定液的碳含量（mgCL1）稀釋倍數(shù)烘干土重（g）；土壤微生物碳：Bc=EcKc式