醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的新挑戰(zhàn)

1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的新挑戰(zhàn),湖南省第二人民醫(yī)院 尹鐵球,OUTLINE,微生物學(xué)發(fā)展簡史感染性疾病與人類自動化儀器的進展分子生物學(xué)在微生物檢驗中的應(yīng)用 細菌鑒定及分類 耐藥性檢測病毒變異的臨床意義,微生物學(xué)發(fā)展簡史,經(jīng)驗微生物學(xué)時期實驗微生物學(xué)時期現(xiàn)代微生物學(xué)時期,認識微生物的歷程,微生物的發(fā)現(xiàn)微生物學(xué)的開山鼻祖——列文虎克微生物學(xué)的奠基人——巴斯德醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的奠基人——科赫,微生物學(xué)的經(jīng)驗

2、時期 (十七世紀上半葉以前) 利用微生物,古希臘時蒸酒,,,微生物在地球上存在了30多億年，人類并不知道一直和微生物生死共處我國公元2000多年前就利用微生物釀酒許多疾病是由微生物引起的：11世紀肺癆我國17世紀初，吳有性醫(yī)生在《瘟疫論》中認為傳染病是“乃天地間別有一種異氣所感”，并且指出“氣即是物，物即是氣”，肯定地預(yù)見有某種實體是傳染病的病原體我國18世紀，描述鼠疫,實驗微生物學(xué)時期 (十七世紀下半葉至二十世紀初)

3、 1、微生物的發(fā)現(xiàn)和微生物形態(tài)學(xué)時期,,,,荷蘭人列文虎克(Leeuwenhoek)(1632-1723)是微生物學(xué)的先驅(qū),微生物學(xué)的開山鼻祖 ——列文虎克,荷蘭人用自己制造的顯微鏡觀察到了被他稱為“小動物”的微生物世界發(fā)現(xiàn)了桿菌、球菌和螺形菌實實在在看到并記錄了一類從前沒有人看到過的微小生命因為這個偉大的發(fā)現(xiàn)，他當上了英國皇家學(xué)會的會員,列文虎克觀察到的微生物,2、微生物生理學(xué)時期 建立了一套獨特的研

4、究方法,尋找各種傳染病病原菌,巴斯德在觀察受狂犬病感染的兔脊髓,,,,巴斯德在工作中,著名的巴斯德研究院,巴斯德在微生物學(xué)上的貢獻,有機物發(fā)酵和腐敗由微生物引起解決葡萄酒和啤酒變酸問題——創(chuàng)立巴氏消毒法解決蠶繭的“微粒子病”的疾病，挽救了法國蠶絲業(yè)主張傳染病是由微生物引起的，并可通過接觸、唾液及糞便傳播19世紀70年代，研究炭疽病，拯救了畜牧業(yè)1881年研制成功減毒活疫苗——開創(chuàng)人類戰(zhàn)勝傳染病的新世紀1885年，巴斯德第一次

5、治好了被瘋狗咬傷的9歲男孩梅斯特——奠定了免疫學(xué)基礎(chǔ),微生物方法學(xué)和醫(yī)學(xué)微生物學(xué)奠基人—— 科赫,科赫,1882年發(fā)現(xiàn)引起結(jié)核病的病原——分離出結(jié)核桿菌創(chuàng)立了微生物學(xué)檢查方法：固體培養(yǎng)技術(shù)、染色技術(shù)、實驗動物感染發(fā)現(xiàn)炭疽桿菌、霍亂弧菌總結(jié)了著名的“科赫法則” ---確立病原微生物1905年獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎,分離細菌的固體培養(yǎng)基,Koch氏確定病原體四要點,在每一例患病的病人中，都應(yīng)找到此種微生物該微生物能

6、被分離，且能在純培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)出的微生物接種于易感動物，一定能導(dǎo)致動物產(chǎn)生該病在實驗性發(fā)病動物中，一定能觀察并重新獲得此種微生物,李斯特在石炭酸噴霧下進行手術(shù),李斯特 無菌操作奠基人,伊凡諾夫斯基 病毒的發(fā)現(xiàn)者歐立希 （Ehrlich） 1910年砷凡納明抗梅毒藥的發(fā)現(xiàn)者,1929年青霉素發(fā)現(xiàn)者弗萊明1940年弗洛瑞提純應(yīng)用于臨床,弗萊明 研究微生物的生命活動,,,,Domagk發(fā)現(xiàn)黃胺藥,Griffith

7、發(fā)現(xiàn)細菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,新病原微生物的確定方面1974年從萊姆(Lyme)病患者分得疏螺旋體1976年在美國費城一次退伍軍人會議期間發(fā)生 肺炎流行,次年分離出軍團菌1983年從慢性胃炎病人活檢標本中分離出 幽門螺桿菌,現(xiàn)代微生物學(xué)時期,二十世紀中葉至今,1986年我國臺灣省分離得肺炎衣原體 1983年首先在美國發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒 （HIV） 近期新發(fā)現(xiàn)的病毒有腎綜合征出血熱病毒、新疆出血熱病毒、B 組輪

8、狀病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒等,1973年以來認識的病原體示例,年份 微生物 疾病1973 輪狀病毒 全球性嬰兒腹瀉的主要原因1976 小隱孢子蟲 急性和慢性腹瀉1977 埃博拉病毒

9、 埃博拉出血熱1977 嗜肺性軍團桿菌 軍團病1977 Hantaan病毒 伴有腎綜合征的出血熱1977 空腸彎曲菌 全球散布的腸病1980 HTLV-I T細胞淋巴

10、瘤白血病1981 金葡萄菌產(chǎn)毒素株 中毒性休克綜合征1982 大腸桿菌O157：H7 出血性腸炎、溶血性尿毒癥1982 HTLV-II 毛細胞白血病1982 Burgdorferi螺旋體 萊姆病1983 HIV

11、 愛滋病1983 幽門螺旋桿菌 消化性潰瘍病1988 HEV 腸道傳播的非A、非B型肝炎1990 Guanarito病毒 委內(nèi)瑞拉出血熱1992 霍亂弧菌O139

12、 與流行性霍亂有關(guān)的新株1992 Hellem巴爾通氏體 貓抓病，桿狀血管瘤病1994 Sabia病毒 巴西出血熱2019 G型肝炎病毒（HGV） 非腸道傳播的非A、非B型肝炎2019 人類皰疹病毒8型 與愛滋病有關(guān)的Kaposi肉瘤2019

13、 TSE致病因子 克羅伊茨非爾特-雅各布病的新變型2019 禽流感病毒A（H5N1） 流感,,湯飛凡發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體,,病原微生物的致病機制方面微生物基因組研究方面微生物檢測技術(shù)方面 防治病原微生物措施方面,感染性疾病與人類,人類已經(jīng)宣布消滅的疾?。禾旎ㄔ谀承┑貐^(qū)已經(jīng)得到控制的疾?。郝檎睢⒓顾杌屹|(zhì)炎、白喉、百日咳、結(jié)核、鼠疫正在流行的疾?。簜?、痢

14、疾、病毒性肝炎、霍亂……,,感染性疾病與人類,新發(fā)生的傳染性疾病原有微生物的再發(fā),,一、新發(fā)生的傳染性疾病,1、原已存在但未被認為是傳染病例如，消化性潰瘍 ,T細胞白血病,2、可能早已存在但未知,技術(shù)進步發(fā)現(xiàn)或人畜接觸機會增加例如，丙型肝炎,萊姆病,3、過去確實不存在,由于微生物發(fā)生變異而產(chǎn)生例如， AIDS, O139 ,耐藥菌株,禽流感,SARS,,新發(fā)生的傳染性疾病的原因,人類的不良行為——進入以前未進入的原始森林和地區(qū)

15、采礦 旅游 開墾 嗜食野生動物 寵物熱——性亂和吸毒氣候都市化——人口遷移 擁擠 易感人群增加 “貧民區(qū)”醫(yī)源性感染和濫用抗生素戰(zhàn)爭 貿(mào)易 水土流失微生物的持續(xù)不斷變異,新近認識的致病微生物,禽流感病毒、SARS、H1N1、產(chǎn)NDM-1細菌……,產(chǎn)NDM-1細菌,超級細菌?,產(chǎn)NDM-1細菌,產(chǎn)NDM-1細菌：全稱“產(chǎn)Ⅰ型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（New Delhi Metallo-β-lactamase 1

16、, NDM-1）腸桿菌科細菌”，簡稱“產(chǎn)NDM-1細菌”，是一種對多種抗菌藥物廣泛耐藥的細菌，主要為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌；特點：屬于腸桿菌科細菌，致病力與普通腸桿菌科細菌沒有差別；由于產(chǎn)生NDM-1導(dǎo)致廣泛耐藥，為“泛耐藥菌”；主要導(dǎo)致醫(yī)院感染；源于南亞地區(qū)，已在全球播散。,細菌耐藥概念,多重耐藥（multiple drug resistance, MRD）: 指細菌同時對三種以上結(jié)構(gòu)不同（作用機制不同）抗菌藥物耐藥，如頭

17、孢菌素、喹諾酮類、氨基糖苷類；泛耐藥（pan-drug resistance, PDR）:細菌對本身敏感的所有藥物耐藥；超級細菌（superbug）:并非科學(xué)概念，一般指PDR與部分MDR，沒有確切定義，以下細菌屬于此列：MRSA/VRSA;VRE;MDR-PA,PDR-AB;ESBL(+)+AmpC(+) 腸桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌（包括產(chǎn)NDM-1細菌）,細菌耐藥的危害,Cosgrove, et al.Clinical

18、Infectious Diseases 2019; 42:S82–9,產(chǎn)與不產(chǎn)ESBL大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌感染的后果比較,細菌耐藥的危害,肖永紅 等，抗生素類藥物濫用公共問題研究，2019,為什么需要關(guān)注產(chǎn)NDM-1細菌,泛耐藥導(dǎo)致的治療挑戰(zhàn)；多種腸桿菌科細菌發(fā)現(xiàn)；快速從南亞地區(qū)傳播到歐美國家；不僅在醫(yī)院感染這種發(fā)現(xiàn)，同時社區(qū)感染這種發(fā)現(xiàn)。,,產(chǎn)NDM-1細菌的發(fā)現(xiàn),2019年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中發(fā)現(xiàn)對碳青霉烯耐藥肺

19、炎克雷伯菌，該菌對所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，對環(huán)丙沙星也不敏感，僅對多粘菌素E敏感；該患者有多年糖尿病和中風史，經(jīng)常往返于印度和瑞典之間，此前4月曾因臀部膿腫在印度住院治療，其后回到瑞典，因尿路感染再度入院；這株細菌攜帶一種新型金屬β-內(nèi)酰胺酶，研究人員根據(jù)患者感染地命名這種酶為NDM-1。,,南亞和英國流行情況,thelancet/infection Published online August 11, 2019 DOI:1

20、0.1016/S1473-3099(10)70143-2,產(chǎn)NDM-1細菌種類,,傳播方式,醫(yī)院內(nèi)感染污染的醫(yī)療器械;污染的醫(yī)療用品;污染的手跨國傳播跨國醫(yī)療旅游,,,,產(chǎn)NDM-1細菌感染臨床特點,產(chǎn)NDM-1細菌主要表現(xiàn)為多重耐藥，致病力與敏感細菌沒有差別；主要引起醫(yī)院感染；有社區(qū)感染報道；感染危險因素：危重患者，入住ICU；長期住院患者；使用廣譜抗菌藥物，或長期應(yīng)用抗菌藥物；插管或侵襲性操作；免疫抑制；呼

21、吸機應(yīng)用;……,產(chǎn)NDM-1細菌感染臨床特點,主要感染類型：泌尿道感染；傷口感染；醫(yī)院肺炎；呼吸機相關(guān)肺炎；血流感染；導(dǎo)管相關(guān)感染； 感染表現(xiàn)沒有特別之處。碳青霉烯治療感染無效，提示該類細菌感染可能，需要及時進行檢查。,,實驗室診斷,產(chǎn)NDM-1細菌感染臨床表現(xiàn)與敏感菌沒有差異，臨床診斷困難；對碳青霉烯治療無效的陰性菌感染需要考慮這類細菌感染可能；診斷主要依據(jù)實驗室檢查結(jié)果；實驗室檢查分為三步：

22、 表型篩查-表型確認-基因確證,產(chǎn)NDM-1細菌表型篩查,美羅培南或亞胺培南紙片法（K-B法，10μg紙片）或最低抑菌濃度（MIC）測定法對腸桿菌科細菌進行初步篩查，達到以下標準，需進行表型確認。 K-B法：美羅培南或亞胺培南抑菌圈直徑≤22mm。MIC測定法：美羅培南MIC≥2mg/L；或亞胺培南對大腸埃希菌、克雷伯菌屬、沙門菌屬和腸桿菌屬MIC≥2mg/L。,亞胺培南,美羅培南,亞胺培南,美羅培南,產(chǎn)NDM

23、-1細菌表型確認,雙紙片協(xié)同試驗:采用亞胺培南(10μg)、EDTA（1500 μg） 兩種紙片進行K-B法，兩紙片距離10-15mm，在含EDTA紙片方向處，亞胺培南抑菌圈擴大，即可判定產(chǎn)金屬酶。,產(chǎn)NDM-1細菌表型確認,采用亞胺培南（美羅培南）/EDTA復(fù)合紙片進行K-B法藥敏試驗，復(fù)合紙片比單藥紙片的抑菌圈直徑增大值≥5mm；亞胺培南（美羅培南）/EDTA 復(fù)合E試條協(xié)同試驗測定MIC，單藥與復(fù)合制劑的MIC比值≥8;即可判定產(chǎn)

24、金屬酶。,產(chǎn)NDM-1細菌基因確證,采用NDM-1的基因特異引物進行PCR擴增及產(chǎn)物測序。,,PCR,測序,各醫(yī)院對陽性結(jié)果須加以復(fù)核，同時菌株送有條件參考實驗室進一步檢測確證。,1.加強對產(chǎn)NDM-1細菌監(jiān)測,醫(yī)院重視臨床微生物檢驗，提高細菌耐藥監(jiān)測能力；臨床參考細菌檢驗結(jié)果應(yīng)用抗菌藥物；定期公布各醫(yī)院細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果；定期回顧細菌耐藥流行趨勢，及時發(fā)現(xiàn)異常耐藥現(xiàn)象，早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)NDM-1細菌加以控制。,2.加強抗菌藥物合理使用監(jiān)

25、管,醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)當有專門抗菌藥物合理使用管理小組，開展教育、培訓(xùn)、監(jiān)督、檢查抗菌藥物使用情況；嚴格執(zhí)行相關(guān)管理規(guī)定，特別是抗菌藥物分類管理規(guī)定。特殊使用抗菌藥物[衛(wèi)生部衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)(2009)38號]第四代頭孢菌素：頭孢吡肟、頭孢匹羅、頭孢噻利等；碳青霉烯類抗菌藥物：亞胺培南/西司他丁、美羅培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南等；多肽類與其他抗菌藥物：萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺等；抗真菌藥物：卡泊芬凈，米卡芬凈，伊

26、曲康唑（口服液、注射劑），伏立康唑（口服劑、注射劑），兩性霉素B含脂制劑等。,3.加強醫(yī)院感染的預(yù)防與控制,加強醫(yī)務(wù)人員感染控制教育、培訓(xùn)，強化對NDM-1細菌等多重耐藥菌感染的預(yù)防、控制的認識。在進行各種侵襲性操作中，嚴格執(zhí)行無菌操作。,,嚴格執(zhí)行《醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生規(guī)范》：醫(yī)療機構(gòu)必須提供充足的手衛(wèi)生設(shè)施。醫(yī)務(wù)人員在接觸病人前后、進行侵入性操作前、接觸病人使用的物品或處理其分泌物、排泄物后，必須洗手或用含醇類速干手消毒劑擦手。,3

27、.加強醫(yī)院感染的預(yù)防與控制,3.加強醫(yī)院感染的預(yù)防與控制,加強對重點部門尤其是ICU物體表面的清潔、消毒 。消毒劑：含氯消毒劑、0.5%過氧乙酸、2%戊二醛、0.5%醋酸環(huán)己啶-乙醇等；表面消毒方法：選擇不同消毒液擦拭或浸泡。,,3.加強醫(yī)院感染的預(yù)防與控制,隔離疑似或確診產(chǎn)NDM-1細菌感染或定植者，預(yù)防耐藥菌傳播。采用接觸隔離，將病人安置單獨房間，接觸患者時需要穿隔離衣、戴手套，相關(guān)醫(yī)療器械或物品如聽診器、血壓計等專用，不能專用

28、的物品，需用后嚴格消毒。隔離期間需要定期檢測耐藥菌情況。,,二、原有微生物的再發(fā),病毒性疾病 狂犬病、登革熱、黃熱病寄生蟲 瘧疾、血吸蟲病、神經(jīng)囊尾幼病、棘阿米巴病、內(nèi)臟利氏曼病、弓形蟲病、賈第蟲病 、棘球幼病細菌性 A群鏈球菌、戰(zhàn)壕熱、鼠疫、白喉 、結(jié)核、百日咳、沙門菌屬、肺炎球菌、霍亂、多重耐藥菌株的流行,,多重耐藥菌株的流行,葡萄球菌腸球菌肺炎鏈球菌腸桿菌科結(jié)核分支桿菌,,多重耐藥

29、的結(jié)核桿菌,是指病人排出的TB至少已對INH和RFP產(chǎn)生耐藥或?qū)?種基本抗癆藥物（INH、RFP、鏈霉素、乙胺丁醇、砒嗪酰胺）中的兩種以上（包括兩種）耐藥者發(fā)生原因：單一化療、不合理化療、不規(guī)律化療對策：合理化療，預(yù)防MTB出現(xiàn)加強檢測，及時檢出MTB 約有75%的臨床分離株存在RNA聚合酶β亞單位基因(rpo B)發(fā)生突變，對RFP耐藥,,腸桿菌科,對三代頭孢菌素耐藥的腸桿菌科在臨床大量出現(xiàn)主要耐藥機制:產(chǎn)生超廣譜β-

30、內(nèi)酰胺酶(Extend-spectrum β-Lactamases,ESBLs)持續(xù)產(chǎn)Ⅰ型β-內(nèi)酰胺酶,腸球菌,可引起多種臨床感染對頭孢菌素、林可霉素、磺胺類呈現(xiàn)天然耐藥,對氨基糖甙類部分天然耐藥現(xiàn)已出現(xiàn)耐萬古霉素的腸球菌(VRE),耐萬古霉素的腸球菌(VRE),由VanA,VanB和VanC控制VanA對萬古霉素和替考拉寧高度耐藥VanB對萬古霉素高度耐藥,對替考拉寧敏感VanC對萬古霉素和替考拉寧高度耐藥選用氯霉素紅霉

31、素四環(huán)素及利福平或其它藥物,葡萄球菌,對甲氧西林耐藥的葡萄球菌對萬古霉素中度敏感的葡萄球菌對萬古霉素耐藥的葡萄球菌,,對甲氧西林耐藥的葡萄球菌,由mecA基因編碼的PBP2a與現(xiàn)有的β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力極低常伴有大內(nèi)環(huán)酯類、林可霉素類和其它抗生素的多重耐藥常呈異質(zhì)性表達萬古霉素是唯一有確切療效的藥物凝固酶陽性和陰性的葡萄球菌均有較高的發(fā)生率,,MRSA的調(diào)控機制,調(diào)控基因 mec I, mec RIMec I 為阻遏

32、基因，其編碼產(chǎn)物為mec I蛋白，為mec A基因的抑制子（repressor)Mec RI 為誘導(dǎo)劑激活基因，在誘導(dǎo)劑存在時編碼mec RI蛋白，是一種輔助誘導(dǎo)因子（co-inducer),解除對mec I蛋白對mec A基因的抑制,,對萬古霉素中度敏感的葡萄球菌（VISA or GISA),對萬古霉素的MIC在8-16ug/ml已有數(shù)起報道、主要發(fā)生在MRS中測定困難：異源性表達、生長緩慢、常規(guī)方法不能識別（K-B法、Mic

33、roScan rapid plate)Vitek 舊版軟件不能測定（只能測到4ug/ml萬古霉素），新版能測定,,三、自動化技術(shù)在微生物學(xué)檢驗中的應(yīng)用,數(shù)碼及數(shù)值鑒定技術(shù)常見的鑒定系統(tǒng),常見的鑒定系統(tǒng),VITEK AMS系統(tǒng) ＭicroScan系統(tǒng)BD BD Phoenix SystemBBL?Crystal?半自動細菌鑒定系統(tǒng)BBL?Crystal? AutoReader自動細菌鑒定系統(tǒng),,使用自動化鑒定儀的局限性,

34、所有實驗室工作人員必須認識儀器的局限性。細菌的分類系統(tǒng)隨著人們對細菌本質(zhì)認識的加深而不斷演變，及時補充和修改數(shù)據(jù)庫是自動化鑒定儀生存的根本要加強對自動化儀器的日常維護和質(zhì)控 自動化鑒定儀得出的結(jié)果，必須要與其它已獲得的生物性狀（如標本來源、菌落特征及其它的生理生化特征）進行核對，以避免錯誤的鑒定。,,四、分子生物學(xué)在微生物檢驗應(yīng)用,核酸雜交(生物芯片）核酸擴增技術(shù) ①靶擴增系統(tǒng)，包括PCR、TMA、SDA；②探針擴增系統(tǒng)，包

35、括Qbeta復(fù)制酶、LCR；③標記擴增技術(shù)。④多重PCR，RT-PCR，nest-PCR，RAPD, PCR-SSCP等技術(shù),,-細菌鑒定及分類,分子生物學(xué)-耐藥性檢測,耐藥基因的檢測糖肽類：vanA，vanB，vanB2,vanC1，vanC3，vanD。β-內(nèi)酰胺類：mecA，blaTEM，blaROB-1，blaSHV，blaIMP，blaMIR-1，blaOXA，blaPER-1，blaPER-2，blaOXY-1，bl

36、aOXA-10/11喹諾酮類：gyrA，gyrB，parE  乙胺丁醇：embB，吡嗪酰胺pncA。利福平rpoB。鏈霉素：rpsL，rrs。異煙肼：katG，inhA，ahpC,,應(yīng)用基因技術(shù)進行分型和鑒定,菌種鑒定菌株分型研究其親緣關(guān)系：復(fù)發(fā)和再感染判斷分析不同種屬間的差別揭示種內(nèi)不同菌株間的細微差異彌補了表型分型的不足多用于分子流行病學(xué)研究,這些技術(shù)包括：RAPDRFLPAFLPSSCPPF

37、GEDNA Sequence,細菌種屬的鑒定,DNA堿基組成的測定,DNA-DNA雜交,16S rRNA同源性分析,細菌種屬特異基因,細菌毒力基因,,,DNA堿基組成的測定,細菌間DNA分子同源程度可以用細菌DNA分子的G+C或A+T摩爾百分比來反映。親源關(guān)系越近的細菌，G+C mol%越相近G+C mol%含量不同的細菌，為不同種細菌含量相同的可能為不同種的細菌不同菌屬間G+C mol%范圍在25%-75%之間。細菌的G+C

38、mol%相當穩(wěn)定，不受培養(yǎng)條件、菌齡和其他外界因素影響。最常用的方法是熱變性法，其次是高效液相色譜法和浮力密度法,DNA-DNA雜交,DNA雜交可得出DNA之間核苷酸順序的互補程度，從而推斷不同細菌基因組間的同源性。目前最常用的是復(fù)性速率法同一菌的復(fù)性率為100%80%-90%的同源為同一種內(nèi)同一亞種的細菌60%-70%同源性為同一種內(nèi)不同亞種的細菌20%-60%同源則是同一屬中的不同菌種這種方法還可對新菌種或表型性狀差別

39、很小而難以肯定的菌株做出較可靠的判定，并可修正其他方法的分類和鑒定錯誤,16S rRNA同源性分析,rRNA-DNA雜交變性rRNA與變性DNA混合時，rRNA與其互補的DNA鏈形成雜交雙鏈，rRNA分子與異源DNA雜交時，也能在其同源區(qū)形成互補雙鏈，這種雜交雙鏈的穩(wěn)定性與其同源性成正相關(guān)，適于細菌屬及屬上水平的分類研究?，F(xiàn)最常用的是硝酸纖維膜結(jié)合法16S rRNA序列測定rRNA分子具有高度保守性，在所有的細胞生物中都存在，在長

40、期的進化中，16SrRNA的總堿基數(shù)有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互對齊進行比較,16S-23S rRNA序列測定,在16S和23S rRNA的間隔區(qū)，各菌種的長度是不一樣的，利用包含16S和23S rRNA部分序列的引物對間隔區(qū)進行擴增，分析其長度多態(tài)，或結(jié)合RFLP技術(shù)進行分析來鑒定菌種此外限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性分析（RFLP）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）、隨機引物擴增法（RAPD）等技術(shù)常用于菌株間的差異比較,細菌種屬

41、特異基因,某些基因為細菌種特有或?qū)俟灿校ㄟ^對這些基因的檢測可以鑒定細菌的種或?qū)偃缇幋a吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是一組只存在于致病性沙門菌中的獨特的保守基因序列。鞭毛蛋白dlh基因通常只存在于傷寒沙門菌IS6110、IS986插入片段為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群所擁有等,細菌毒力基因,某些以毒素致病的細菌含有特定的毒力基因霍亂弧菌的霍亂毒素基因產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌的耐熱（ST

42、）和不耐熱腸毒素（LT）白喉棒狀桿菌的外毒素基因可以應(yīng)用以上技術(shù)測定毒力基因的存在，以示相應(yīng)的細菌存在,五、病毒變異的臨床意義,病毒突變體的起源,某些病毒的基因突變率可高達10-3～10-4（例如逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV），而有些病毒突變率僅為10-8～10-11（如皰疹病毒），相當于細胞DNA的自發(fā)突變率。大多數(shù)RNA病毒的突變率要遠遠高于DNA病毒誘發(fā)突變 突變具有雙重作用，病毒突變可使其抗原性發(fā)生改變,從而逃逸免疫應(yīng)答，但大

43、多數(shù)突變是有害的，并會產(chǎn)生許多缺陷顆粒人工突變 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以對病毒基因組進行突變，如直接誘發(fā)寡核苷酸突變和基于PCR的基因突變技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)在結(jié)合酶消化技術(shù)（引起基因缺失）和接頭掃描技術(shù)（形成基因插入），可以在病毒基因組的任何特異性位點，準確安全地誘導(dǎo)出幾乎任何類型的突變。這類突變可成為人工突變。,病毒突變的類型,生化標志物基因突變：耐藥基因突變，導(dǎo)致病毒毒力改變的特異突變；形成多態(tài)性，使蛋白質(zhì)和核酸電泳

44、遷移率發(fā)生改變以及對滅活劑的敏感性改變。缺失突變：在某些方面與無義突變相似，但可以是一個或多個病毒基因缺失，也可以是基因組中非編碼調(diào)控區(qū)（如啟動子等）的缺失。自發(fā)缺失突變體通常可在病毒群體中累積，生成大量缺陷-干擾（D.I.）顆粒。盡管這些顆粒不具有感染性，但仍有一定的遺傳學(xué)上的意義，有人認為它們在某些病毒感染過程中以及發(fā)病機理方面起著重要作用。通過重組，可以使基因缺失病毒回復(fù)突變?yōu)橐吧筒《?，但發(fā)生頻率通常比較低。,肝炎病毒的變異

45、及基因分型概述,HAV為小RNA病毒科成員，現(xiàn)已被歸入嗜肝RNA病毒科。人源HAV存在4個基因型（Ⅰ—Ⅳ型），型間核苷酸同源性85%.不同基因型的HAV抗原性相同，因此，HAV只有一個血清型HBV為嗜肝DNA病毒科成員，可分為6個基因型（基因型A—F）,不同地域、人種的HBV基因型可能有著不同的分布?；蛐偷牟町惻c致病性、抗病毒治療效果、預(yù)后等的關(guān)系尚無明確結(jié)論，尚待進一步研究,肝炎病毒的變異及基因分型概述,HDV是一種RNA缺陷病

46、毒現(xiàn)被歸類于衛(wèi)星病毒科成員。世界各地HDV不同分離株的核苷酸變異在11%～17%之間。HDV可分為3個基因型 ，大部分分離株為Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型分別在日本和南美多見。 HCV為黃病毒科成員，該病毒變異較大，目前至少存在6個以上的基因型。HCV的基因型與致病、預(yù)后、干擾素的治療等密切相關(guān)，需引起高度重視。 HEV為環(huán)狀病毒科成員，感染后導(dǎo)致急性肝炎，臨床表現(xiàn)和發(fā)病經(jīng)過與甲型肝炎有一定差異，比如妊娠婦女感染的死亡率較高；發(fā)病者年齡分

47、布不明顯；更容易發(fā)生瘀膽；重型肝炎的發(fā)生率高于甲肝；患病后無終身免疫等等。世界各地的HEV分離株可分為2個基因型，即緬甸型和墨西哥型，我國、東南亞各國及印度流行的為緬甸型。,HBV--生物學(xué)特性,不完全閉合環(huán)狀雙鏈DNAS、C、P和X 4個ORFsS基因C基因P基因X基因,S基因區(qū)變異,S基因區(qū)包括前S1、前S2及S基因，分別編碼前S1蛋白、前S2蛋白及主蛋白前S1蛋白能調(diào)節(jié)HBsAg的分泌；它的第21～47aa是HBV與靶

48、細胞上特異受體結(jié)合的主要部位，但第3～77aa均參與HBV感染靶細胞的過程前S2蛋白N末端的5個aa是自被感染細胞內(nèi)分泌完整病毒顆粒所必需的。前S1起始碼下游第230堿基，可突變形成終止碼，并影響前S2起始碼，這種突變與HBV逃避干擾素治療和宿主免疫清除有關(guān)HBV DNA第2995-3177nt位于前S開放讀碼框(ORF)內(nèi)，但其缺失可削弱前S的免疫性，但仍能保留與肝細胞的結(jié)合位點，有利于HBV逃避機體的免疫攻擊，形成慢性攜帶狀態(tài)。

49、,S基因區(qū)變異,HBsAg第99-169aa是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的決定簇。124-137aa和138-l47aa，特別是第142，l44，145aa三處突變，包括典型的“疫苗逃避株”145甘氨酸→精氨酸。這些突變可削弱或改變HBsAg的免疫原性，降低HBsAg被HBIG識別的能力；這些突變可能是長期免疫壓力篩選的結(jié)果。,P基因區(qū)變異,P基因區(qū)編碼HBV DNA聚合酶(DNAP)，其自然突變率與逆轉(zhuǎn)錄病毒gag基因相近，每年約為2

50、15;10-4堿基／位點抗HBV藥物胞苷類似物拉咪呋啶(1amivudine)和鳥苷類似物泛昔洛韋(famciclovir) ，主要作用于DNAP，通過與底物dNTP競爭結(jié)合以抑制HBV的逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制HBV耐藥株的突變就發(fā)生在DNAP基因內(nèi)。DNAP催化中心由“酪氨酰(Y)、蛋氨酰(M)、天冬氨酰(D)”基序(YMDD motif)組成，是DNAP發(fā)揮催化活性所必需的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。針對核苷類藥物的抗病毒治療，病毒YMDD中M突變?yōu)楫?/p>

51、亮氨酸(I)或纈氨酸(V)。發(fā)生突變以后可能使病情加?。此^反跳），對所用藥物產(chǎn)生耐受,S基因區(qū)和P基因區(qū)變異的相互影響,由于S基因區(qū)完全重疊于P基因區(qū)內(nèi)，特別是HBsAg決定簇區(qū)和DNAP致第454-524aa(系主要催化活性區(qū))相重疊，因此，與拉咪夫丁等抗病毒藥相關(guān)的DNAP的突變至少可致HBsAg中5處aa改變DNAP的突變正好位于HBsAg決定簇區(qū)(主要親水區(qū))，提示該處P基因的突變也可導(dǎo)致“中和逃避(neutralizat

52、ion escape)”,C基因區(qū)的調(diào)控序列：,C基因區(qū)中前C和C基因上游的調(diào)控序列基本C區(qū)啟動子(basal core promoter，BCP) 可啟動前C mRNA和C mRNA的轉(zhuǎn)錄核心上游調(diào)節(jié)序列(core upstream regulatory sequcnce，CURS) 能定向調(diào)節(jié)BCP的活性負調(diào)節(jié)元件(negative regulatory element,NRE)，可抑制或消除CURS的活性,C基因區(qū)調(diào)控序列

53、的變異,C基因區(qū)調(diào)控序列均可發(fā)生變異，其中最重要和最常見的突變是BCP中的1762nt A→T，l764nt G→A，兩者常同時出現(xiàn)，與活動性肝炎、肝硬變、肝癌、急性肝衰竭等相關(guān)，在后者又常合并l653nt C→T。體外試驗顯示這三處聯(lián)合突變可明顯減少前C mRNA及HBeAg的產(chǎn)生。T1762 A1764變異很少在急性肝炎中檢出，主要出現(xiàn)于慢性感染過程中，可能是宿主免疫篩選的結(jié)果。T1762突變亦多出現(xiàn)于HBeAg／抗HBe

54、血清學(xué)轉(zhuǎn)換時，可作為判斷HBeAg(+)免疫耐受者發(fā)生免疫激活的指標，以及干擾素治療時選擇合適病例的一個依據(jù)。,前C基因突變：,前C基因亦可發(fā)生多處位點突變，最有臨床意義的突變是l896nt G→A，可使前C區(qū)第28密碼子TGG(色氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止碼TAG，導(dǎo)致前C蛋白翻譯中斷，HBeAg不能產(chǎn)生；前C起始碼亦可發(fā)生突變而不能啟動HBeAg合成，此突變有助于HBV逃避免疫攻擊而形成慢性感染狀態(tài)，也見于干擾素治療后，提示以HBeAg轉(zhuǎn)陰

55、作為疾病好轉(zhuǎn)的指標有時并不準確。病毒復(fù)制受到干擾后，有可能提高HBV DNA整合入宿主染色體的能力，從而致癌。前C突變先于抗HBe( + )出現(xiàn)者，可能是干擾素等藥物誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)換，反之則可能是回復(fù)突變，因為在抗HBe→HBeAg逆轉(zhuǎn)換者的血清中只測及HBV野生株。,C基因突變：,C基因可發(fā)生多位點多種類型的突變，是HBV感染慢性化、肝細胞損傷加重的重要原因。有3個突變集中區(qū)域：第48-60aa；第84-10laa，其中第87-97a

56、a更是一變異熱點；第l47-155aa，此處系前體蛋白處理位點，相應(yīng)的DNA序列發(fā)生錯義突變或出現(xiàn)終止碼將減少病毒蛋白的產(chǎn)生和分泌。Cariani報道前C基因變異可同時合并前S或S基因變異，不能同時合成HBcAg、前S蛋白等免疫原性蛋白，使HBV更易逃避免疫清除。C區(qū)內(nèi)部缺失突變(core internal deletion，CID)的HBV自然變異株，可見于所有無癥狀攜帶者、l4％～100％的慢性乙型肝炎患者(香港地區(qū)檢出率僅7％

57、)，以及肝細胞肝癌、腎移植后使用免疫抑制劑者，但很少在急性肝炎患者中檢出,（五）X基因區(qū)變異,HBxAg也可能成為致敏CTL攻擊的靶抗原?；颊哐逯锌扇苄訦BxAg相關(guān)多肽可調(diào)節(jié)CTL對靶細胞的免疫識別，因此ORF-X變異可能亦不利于清除HBVHBxAg是一種強力反式激活因子，可通過多種途徑促發(fā)肝細胞癌變,丙型肝炎病毒變異的意義,HCV RNA 的突變率是真核和原核DNA 復(fù)制突變率的106倍，達10-3～10-4nt/堿基位點.年。

58、以點突變?yōu)橹?，偶可出現(xiàn)插入突變及缺失突變，但核苷酸插入或缺失為3的倍數(shù)。在進化過程中，5’NCR和C最保守，NS其次，E最易變異，尤以E2／NSl基因NH2-末端的高變區(qū)(HVRl)為甚。HVRl變異有下述生物學(xué)意義。免疫逃逸慢性化,基因分型,Simmonds等根據(jù)病毒基因組核苷酸序列的同源性提出了一個HCV基因型分類命名系統(tǒng)該系統(tǒng)將HCV分為6個主要基因型。每型又由若干亞型組成，不同基因型之間全基因組序列差異達30％以上

59、或氨基酸差異達25％～30％，同一基因型中不同亞型之間全基因組序列差異達20％以上現(xiàn)在有全基因組序列資料的僅1a、1b、2a、2b和3b等5型，亞基因區(qū)序列比較也可取得可信的相同結(jié)果，且更簡便。目前已知的各基因型E1、NS4、NS5基因序列資料可用于鑒定HCV新的基因型、亞型和無流行病學(xué)意義的分離株。迄今已發(fā)現(xiàn)HCV的主要基因型有11個，亞型70余個。,HCV基因型的地理分布特點,HCV基因型分布存在明顯的地理差異其中1a型在美國

60、、巴西和歐洲西北部占優(yōu)勢，1b型在遠東、歐洲東西部多見，2a和2b型多分布于亞洲和歐洲，3a型在西方一些國家以及泰國、新加坡多見，并在東印度和孟加拉國的一些感染人群中的唯一基因型。其他少見基因型的分布則局限于某些持殊區(qū)域，如4型在中東和中非占優(yōu)勢；5a型局限于南非；6a型主要見于香港、麥加和越南。,HCV基因型的地理分布特點,中國大陸僅有1b和2a兩型，且以1b型為主，在南方城市(南京、南寧、成都)，1b型占90％以上，北方城市

61、(哈爾濱、沈陽、蘭州)，2a型占46％～70％。大陸的HCV基因型多樣性不如香港、臺灣及日本，但混合感染率明顯高于其他國家和地區(qū)。郭林生等采用Enomoto分型法在10余省、市的122例血清標本中發(fā)現(xiàn)5個基因型(RT、K1、K2a、K2b、K3)，其中K1和K2型占75.4％。目前我國在HCV基因分型中所用方法難以檢出6a或其他新基因型，因此不能除外有其他基因型感染的可能。    迄今尚難對H

62、CV基因型的地理分布作出解釋。,研究HCV基因型的意義,作為IFN藥效的預(yù)測指標IFN是目前首選的抗HCV藥，但反應(yīng)率僅25％左右。,基因型是IFN藥效的最重要預(yù)測指標,K1／1b型和K2a／2a型的長期緩解率分別為40％和91％。1b型的效果低于1a、2a、2b和3型者，4、5、6型HCV對IFN治療的反應(yīng)性尚不清楚。在IFN治療前應(yīng)檢測病人的HCV基因型和血清病毒量，并以此作為療效預(yù)測指標。IFN治療2周后肝組織中負鏈HCV

63、 RNA陰性也是預(yù)測IFN長期療效的有用指標。1b型對IFN治療的低反應(yīng)性原因尚不完全清楚，可能與1b型HCV的E2／NS1糖蛋白高變區(qū)異質(zhì)性程度及病毒復(fù)制能力較強有關(guān)。,研究HCV基因型的意義,與肝損害程度的關(guān)系：文獻報道1b型HCV與重度慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌(HCC)關(guān)系密切。1b型者肝組織學(xué)分級、分期的惡化進展速度及血清平均HCV RNA效價均明顯高于2型；1b型較其他型引起更嚴重的肝損害；肝細胞癌患者中1b型陽性率

64、明顯高于慢性肝炎和肝硬化者。,研究HCV基因型的意義,1b型HCV致病性較強的可能機制是：① E基因區(qū)另有一高變區(qū)，隨時間推移其突變率增加3～4培，使病毒有可能逃避宿主的免疫監(jiān)視；② 表達或編碼的蛋白有較強的細胞毒作用。多因素分析顯示1b型是肝癌發(fā)生最重要的危險因子也有不支持上述觀點，需進一步研究包括建立體內(nèi)、體外HCV復(fù)制和蛋白表達模型等,研究HCV基因型的意義,HCV感染的診斷：HCV各基因型的基因組核苷酸序列差異導(dǎo)致其表達的蛋

65、白免疫原性和抗原性的區(qū)別，抗原性變異，尤以非結(jié)構(gòu)編碼區(qū)蛋白如C33(NS3)、C-100(NS4)、NS5(NS5a)較大目前所使用的第3代抗體幾乎都來自1a型HCV的重組蛋白抗原，感染1a型的獻血者抗體血清效價是感染2、3型者的4.5倍，在非1型感染為主的國家應(yīng)用此抗體檢測時應(yīng)慎重解釋檢測結(jié)果。目前有學(xué)者采用不同基因型HCV的重組蛋白建立HCV抗體檢測方法，應(yīng)根據(jù)本地HCV基因型特點研制診斷試劑,研究HCV基因型的意義,HCV疫苗

66、的制備：有效的疫苗是防治HCV感染的重要手段。有效的HCV疫苗應(yīng)包含各主要基因型的免疫原，研制HCV疫苗還有許多問題需要解決，最重要的是要明確是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體為主，還是以激發(fā)細胞毒T細胞活性為主，目前認為以C和NS3蛋白或多肽(與高度保守的T細胞位相一致)為基礎(chǔ)的疫苗比E蛋白更能誘導(dǎo)廣泛的交叉保護反應(yīng)。其他：HCV基因型研究對鑒定傳染源和追蹤傳播途徑也有重要意義,復(fù)習(xí)題,目前臨床常見的耐藥問題有哪些？用分子生物學(xué)的手段怎樣鑒