柑橘基因組進化和果實采后轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、柑橘基因組學(xué)研究在理解基因組結(jié)構(gòu)特征及基因-性狀之間聯(lián)系等方面取得了飛速發(fā)展，并積累了大批的數(shù)據(jù)。本實驗室對甜橙基因組開展了denovo測序并獲得其基因組草圖。同時高通量分析技術(shù)也是研究柑橘響應(yīng)貯藏逆境脅迫、揭示果實采后生命活動規(guī)律的重要新興手段。本研究中，我們分別從基因組大小進化和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式等生物學(xué)角度出發(fā)解析這些序列數(shù)據(jù)和分子生理數(shù)據(jù)的屬性特征及相互關(guān)系，主要包括了四部分內(nèi)容:(1)分析柑橘轉(zhuǎn)座元件的組成、類別、進化模式、活性

2、和柑橘群體間的插入差異等;(2)研究全基因組復(fù)制在柑橘物種形成過程中發(fā)生的次數(shù)和時間，并通過共線性分析揭示柑橘染色體進化機制;(3)基于基因表達(dá)譜芯片解析椪柑低溫貯藏中生理變化的主要調(diào)控元件和關(guān)鍵功能模塊;(4)從結(jié)構(gòu)、生理代謝和基因表達(dá)等水平研究采后打蠟處理對椪柑果實線粒體的影響。主要結(jié)果如下:
　　1.柑橘轉(zhuǎn)座元件的注釋和進化特征
　　(1)轉(zhuǎn)座元件在甜橙和克里曼丁橘基因組序列中分別占18.38％和20.56％。其中反轉(zhuǎn)

3、錄轉(zhuǎn)座子在全部轉(zhuǎn)座元件序列中所占的比率為95％，而DNA轉(zhuǎn)座子儀占5％。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的Copia和Gypsy類型是含量最多的轉(zhuǎn)座元件類型，分別占40％和50％左右。
　　(2)在甜橙基因組中分析得到了1331條全長反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，并依據(jù)序列相似度將其歸于198個Copia家族和130個Gypsy家族;在克里曼丁橘基因組中得到2394條全長反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座了，將其歸于213個Copia家族和99個Gypsy家族。兩個基因組中的80％反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)

4、座子家族所含全長序列成員數(shù)都小于5個，表明這些家族有著較低的基因組擴增速率。而15個所含成員最多的家族分別占甜橙和克里曼丁橘基因組總序列的10％和13.9％?；赗T結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，Copia家族的擴增有著明顯的進化分支偏好性。
　　(3)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座予在甜橙和克里曼丁橘基因組中半衰期分別為0.67myr和0.55myr，且不同家族有著不同的擴增高峰期。
　　(4)部分反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族仍保留轉(zhuǎn)錄活性，并在塑造柑橘不同

5、品種基因組結(jié)構(gòu)中發(fā)揮了作用。
　　2.柑橘全基因組復(fù)制
　　(1)甜橙943個標(biāo)記的連鎖圖用于定位了161個denovo測序得到的scaffolds，總長為239Mb，含有的基因數(shù)目為22873個。
　　(2)在甜橙染色體1-2-4，3-4-6，3-5-9，5-7-8，4-6-8，1-4-7之間檢測到同源倍增區(qū)段，對應(yīng)著1321對同源基因。這些基因的Ks分布呈正態(tài)分布特征并只含有一個峰值(Ks=1.27)，推測在柑橘基

6、因組進化過程中只發(fā)生過古老的γ復(fù)制事件，而沒有發(fā)生新的全基因組復(fù)制。
　　(3)柑橘基因組和擬南芥、可可、蘋果、草莓、葡萄基因組共線性分析表明柑橘和可可、葡萄基因組有著較高的共線性關(guān)系，從而說明甜橙較好地保留了古老染色體狀態(tài)。而至少發(fā)生了49次重組和融合事件后導(dǎo)致柑橘染色體從古老雙子葉祖先的X=7狀態(tài)進化到現(xiàn)今X=9的染色體核型。
　　3.椪柑（CitrusreticulataBlanco）采后低溫貯藏轉(zhuǎn)錄組分析
　　

7、(1)椪柑表達(dá)譜芯片結(jié)果表明，低溫貯藏轉(zhuǎn)錄本中有2161個差異表達(dá)基因，包含了975個上調(diào)表達(dá)和1186個下調(diào)表達(dá)的基因。而表達(dá)改變主要發(fā)生在低溫貯藏60d以后。上調(diào)表達(dá)基因主要對應(yīng)了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，逆境脅迫應(yīng)答因子和激素信號等功能。
　　(2)有92個與激素相關(guān)的基因和98個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平發(fā)生了改變。其中乙烯信號途徑相關(guān)基因表達(dá)均上調(diào)，而AP2-EREBP和C2H2轉(zhuǎn)錄因子家族上調(diào)表達(dá)數(shù)日達(dá)到顯著水平。
　　(3)可溶性糖

8、（蔗糖，葡萄糖和果糖）變化模式都為貯藏前60d略有上升，而60d后下降。而相應(yīng)的蔗糖酶表達(dá)上升，淀粉水解酶表達(dá)下降。
　　4.椪柑（CitrusreticulataBlanco）采后低氧脅迫與線粒體功能的關(guān)系
　　(1)經(jīng)打蠟處理后的果實，乙醇和乙醛含量提高顯著;ATP和NADPH下降顯著;POD活性下降顯著;線粒體結(jié)構(gòu)變化明顯，表現(xiàn)為內(nèi)嵴消失，線粒體蛋白溢出等。
　　(2)對打蠟果實的代謝組分析得到50種代謝物，其中

9、有18種物質(zhì)含量變化顯著，包括有機酸，氨基酸，嘌呤，糖和糖衍生物等。
　　(3)通過同源序列法，我們獲得了400個線粒體定位蛋白，217個葉綠體定位蛋白，116個液泡定位蛋白和119個質(zhì)膜定位蛋白的相應(yīng)核苷酸序列信息，并與597柑橘轉(zhuǎn)錄因子一并設(shè)計探針，定制了一款含1569個基因的Agilent寡核苷酸芯片。
　　(4)在常溫(R)，打蠟常溫(WR)和打蠟低溫(WL)三種貯藏條件下，一共有474個差異表達(dá)基因;而這三種貯藏條

10、件對應(yīng)的差異基因數(shù)目分別為181，400和90，表明WR果實中基因表達(dá)變化最大。
　　(5)變化顯著的功能模塊中，NADH參與的ATP合成模塊、N代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等為上調(diào)表達(dá)模塊，而其余的多為下調(diào)表達(dá)功能模塊。
　　(6)在R，WR，WL貯藏條件果實中分別有68，180，70個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括了AP2-EREBP，NAC，WRKY，C2H2，MYB-related家族等;其中AP2-EREBP和HB家族的部分成員與