應(yīng)用分子生物學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)快速鑒定金黃色葡萄球菌.pdf

1、金黃色葡萄球菌是分布最廣泛的致病菌之一,它分泌多種毒力因子[1],可導(dǎo)致肺炎,傷口感染及食物中毒等嚴(yán)重疾病,占醫(yī)院感染病例的10％。近年來,隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,導(dǎo)致了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的大量出現(xiàn),使其成為與艾滋病、乙型肝炎并列的世界三大感染頑疾。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便,所需設(shè)備簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn),但都存在耗時(shí)長、靈敏性差的缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和蛋白組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)也從傳統(tǒng)方法過渡到以PCR、

2、雜交探針、基因芯片和MS為主的現(xiàn)代技術(shù)上,從基因和蛋白質(zhì)水平更準(zhǔn)確、更靈敏的檢測(cè)病原菌的存在。本研究首先采用PCR-RFLP(聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析)鑒定了臨床常見的葡萄球菌,然后利用差異蛋白組學(xué)的方法,運(yùn)用SELDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌以及其他對(duì)照組細(xì)菌的蛋白指紋圖譜,并篩選出金黃色葡萄球菌的特異表達(dá)蛋白標(biāo)志物,建立決策樹預(yù)測(cè)模型,探討其用于金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)室診斷的臨床價(jià)值。
　　 目的：

3、
　　 細(xì)菌分子水平的鑒定是目前臨床實(shí)驗(yàn)室微生物領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本研究利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長度多態(tài)性分析技術(shù)和差異蛋白組學(xué)技術(shù)快速鑒定臨床常見的金黃色葡萄球菌,為臨床微生物鑒定方法的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.采用四種DNA提取方法提取金黃色葡萄球菌DNA,篩選適宜的DNA提取方案。2.PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的16SrDNA,產(chǎn)物測(cè)序,結(jié)果與GenBank比對(duì)進(jìn)行鑒定。3.獲取葡萄球菌t

4、uf基因序列,通過軟件分析tuf基因的酶切位點(diǎn)和酶切模式。優(yōu)化PCR檢測(cè)tuf基因的反應(yīng)條件,采用PCR擴(kuò)增葡萄球菌tuf基因,產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶AluI,HinfI酶切后,瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物,根據(jù)酶切模式對(duì)葡萄球菌進(jìn)行鑒定。4.選擇不同激光強(qiáng)度,探討并建立SELDI-TOF-MS檢測(cè)細(xì)菌蛋白指紋圖譜的條件。5.收集培養(yǎng)24h、48h、72h的金黃色葡萄球菌,SELDI-TOF-MS檢測(cè)其蛋白指紋圖譜,分析培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛋白指紋檢測(cè)

5、的影響。6.將3株金黃色葡萄球菌均重復(fù)檢測(cè)20次,分析SELDI-TOF-MS檢測(cè)細(xì)菌蛋白指紋的重復(fù)性。7.選取60株金黃色葡萄球菌和84株對(duì)照細(xì)菌為訓(xùn)練集,56株金黃色葡萄細(xì)菌和75株對(duì)照細(xì)菌為驗(yàn)證集,采用SELDI-TOF-MS檢測(cè)訓(xùn)練集和驗(yàn)證集細(xì)菌蛋白指紋圖譜。利用Biomarker Wizard軟件篩選金黃色葡萄球菌特征性蛋白,通過Biomarker Pattems軟件建立金黃色葡萄球菌決策樹診斷模型。8.利用驗(yàn)證集中56株金黃

6、色葡萄球菌和75株對(duì)照細(xì)菌蛋白指紋圖對(duì)建立的診斷模型進(jìn)行盲法驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 1.四種DNA提取方法中,只有改良NaOH方法能成功提取金黃色葡萄球菌DNA。2.所有金黃色葡萄球菌均能擴(kuò)增出16SrDNA,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank的金黃色葡萄球菌序列比對(duì),相似性均大于99.5％。3.軟件分析發(fā)現(xiàn),葡萄球菌tuf基因具有AluI,HinfI等多個(gè)酶切位點(diǎn),tuf基因經(jīng)過.AluI,HinfI酶切的產(chǎn)物

7、具有特征性,可將不同的葡萄球菌區(qū)分開。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件下,不同的葡萄球菌均能擴(kuò)增出668bp的產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)過AluI,HinfI酶切后,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,酶切結(jié)果與理論相符,并能區(qū)分金黃色葡萄球菌。4.不同激光強(qiáng)度下,細(xì)菌蛋白指紋圖譜略有差異,以激光強(qiáng)度為190檢測(cè)結(jié)果最佳。5.金黃色葡萄球菌經(jīng)培養(yǎng)24h、48h、72h后,SELDI-TOF-MS質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于細(xì)菌蛋白的表達(dá)有一定影響,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)

8、有多個(gè)蛋白標(biāo)志物在不同時(shí)間均穩(wěn)定表達(dá)。6.金黃色葡萄球菌重復(fù)檢測(cè)20次,6個(gè)特征蛋白峰的分子量變異系數(shù)均≤0.05％,提示SELDI-TOF-MS檢測(cè)葡萄球菌特征性蛋白具有很好的重復(fù)性。7.SEILDI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果顯示,所有金黃色葡萄球菌均具有相似的蛋白指紋圖譜,在分子量3000-20000Da范圍內(nèi)共檢測(cè)到75個(gè)蛋白質(zhì)峰,其中47個(gè)蛋白質(zhì)峰差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),其中以質(zhì)荷比(M／Z)為13113、4458的2

9、個(gè)蛋白的差異最明顯。利用Biomarker Patterns軟件建立了一種金黃色葡萄球菌決策樹分類鑒定模型。8.盲法驗(yàn)證結(jié)果表明,該分類鑒定模型對(duì)金黃色葡萄球菌診斷靈敏性和特異性均為100％。
　　 結(jié)論：
　　 本研究成功建立了一種可區(qū)分不同葡萄球菌的PCR-RFLP方法。同時(shí)采用SELDI-TOF-MS技術(shù)構(gòu)建了多種細(xì)菌的蛋白指紋圖譜,利用Biomarker Patterns軟件建立了一種金黃色葡萄球菌的蛋白決策樹分