海洋石油降解菌的篩選、菌群構(gòu)建及降解基因的初步研究.pdf

1、隨著海洋石油開(kāi)采及海上油運(yùn)的發(fā)展，溢油事故頻頻發(fā)生，造成嚴(yán)重的海洋石油污染。石油污染給海洋環(huán)境和海洋生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)了嚴(yán)重的危害，直接或間接的影響著人類(lèi)的生存和可持續(xù)發(fā)展。目前國(guó)際上常用的治理方法主要有物理、化學(xué)和生物處理法三類(lèi)，其中生物修復(fù)技術(shù)由于具有原位處理、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。微生物在海洋溢油的生物修復(fù)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，如何篩選并構(gòu)建高效石油降解菌已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。在微生物降解石油過(guò)程中，通常是由烷

2、烴羥化酶基因（alkB）及其編碼的烷烴羥化酶啟動(dòng)了烷烴的降解，烷烴羥化酶也是整個(gè)降解途徑中的關(guān)鍵酶。因此，對(duì)烷烴降解菌和烷烴羥化酶基因的研究對(duì)于了解石油降解菌的降解機(jī)制，完善生物修復(fù)技術(shù)具有較高的理論和應(yīng)用價(jià)值。 本文以石油為唯一碳源，從勝利油田灘涂、南海及黃海沉積物、青島沿岸河口及近海潮間帶地區(qū)8個(gè)站點(diǎn)篩選出42株細(xì)菌，它們屬于18個(gè)不同的屬，其中γ-變形菌綱（64％）和α-變形菌綱（19％）較為豐富，其次為放線菌綱（10％

3、），黃桿菌綱（5％）和β-變形菌綱（2％）。通過(guò)單菌石油降解能力驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)存13株菌具有較強(qiáng)的石油乳化和降解能力，包括Halomonas菌（5株），Marinobacter菌（2株），Psychrobacter菌（2株），Sphingomonas菌（2株），Alcanivorax菌（1株），Thalassospira菌（1株）。這13株菌對(duì)石油的降解率在80．3％～85．5％之間，均能降解短鏈及長(zhǎng)鏈烷烴，其中菌株SL4C具有降解萘和菲的

4、能力；這13株菌均有一定降低水油界面張力的能力，添加降解菌的樣品測(cè)得的表面張力在31．56～47．13 mN/m之間，明顯低于對(duì)照樣品的表面張力（55．46 mN/m）。結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)對(duì)勝利油田灘涂區(qū)進(jìn)行菌群多樣性分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)優(yōu)勢(shì)菌群有γ-變形菌綱（61％）、ε-變形菌綱（11％）、放線菌綱（11％）、黃桿菌綱（11％）和α-變形菌綱（5．5％）。 基于石油降解菌降解特性以及勝利油田菌群多樣性分析，挑選9株石油降解

5、菌構(gòu)建3個(gè)降解菌群，通過(guò)平板計(jì)數(shù)及PCR-DGGE技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)菌群結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示降解菌間存在明顯的相互抑制和協(xié)同作用：芳烴降解菌SL4C較難與其他降解菌配伍使用，同菌屬間拮抗作用較小。3個(gè)降解菌群對(duì)石油的降解率在90．1％～93．8％之間，高于單菌對(duì)石油的降解率。 設(shè)計(jì)4對(duì)引物擴(kuò)增一株海桿菌（Marinobacter sp． P1-14D）的烷烴羥化酶基因，得到alkB1（801bp）和alkB2（1302bp）兩條基因片

6、段。其中alkB1與Marinobacter。aquaeolei VT8 alkB2相似度98．25％，氨基酸相似度98．50％；alkB2與M aquaeolei VT8 alkB1相似度99．01％，氨基酸相似度99．77％。AlkB1和alkB2與已知alkB基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性，均含有烷烴羥化酶的四個(gè)保守基序（His-1、His-2、HYG和His-3），組成一個(gè)8組氨酸區(qū)域，該區(qū)域相對(duì)保守而且包含了烷烴羥化酶活