海洋環(huán)己酮降解菌及環(huán)己酮降解基因的研究.pdf

1、“21世紀是手性化學發(fā)展的世紀”， 2001年諾貝爾化學獎就授予分子手性催化的主要貢獻者。很多藥物及生物活性物質是具有手性特征的，手性制藥是目前醫(yī)藥行業(yè)的前沿領域和高速增長的領域，是各大制藥企業(yè)競爭的熱點之一，手性技術也是21世紀勢必快速發(fā)展的領域。不僅僅是醫(yī)藥領域，食品，化工，微電子，材料，等眾多領域都會因為手性技術的發(fā)展得到巨大改變。而目前所有手性催化劑中，將酮催化為具有手性的酯的最佳催化劑是在不動桿菌中發(fā)現(xiàn)的環(huán)己酮單加氧酶。

2、 本文從太平洋深海獲得了一株可利用環(huán)己酮為唯一碳源進行生長的微球菌CN1，該菌不僅表現(xiàn)出除轉化環(huán)己酮外的諸多性能。如不具有致病性，生長速度快，而且可耐受高濃度環(huán)己酮(>44％)，并且在16％(V/V)的環(huán)己酮中生長最好。CN1可在12mM的重鉻酸鉀中生長，可利用高濃度氰化鉀(250mM)，還能產生植物生長素——吲哚乙酸。而CN1表現(xiàn)的最重要的功能是，它可以高轉化率，高手性率的將極為廉價的非手性藥物中間體雙環(huán)[3，2，0]-2-雙鍵-

3、6-酮加氧轉化為極為昂貴的手性酯，生成物與反應物的市場價格相差近1000倍。 不同于已有報道，環(huán)戊酮卻不能被CN1轉化，表明CN1中的環(huán)己酮加氧酶有著較為特別的底物利用范圍。環(huán)己酮可被CN1降解，環(huán)己醇可轉化為環(huán)己酮后降解，環(huán)己醇又阻礙自身通過環(huán)己酮途徑降解。環(huán)己酮在氧氣不充足或環(huán)己酮較多的情況下，轉化為環(huán)己醇。通過分析環(huán)己酮降解的中間代謝產物發(fā)現(xiàn)，環(huán)己酮有多種途徑進行代謝，不僅可通過B-氧化途徑降解，通過轉化為環(huán)己醇后合成其

4、他物質，還有可能直接水解。 通過Southern雜交，結合基因組文庫構建，獲得了環(huán)己酮降解的完整基因簇。整個基因簇與具有高GC含量的紅球菌，節(jié)桿菌的基因簇比較接近，而與目前研究的較深入的不動桿菌的基因簇無論從單個基因還是基因排布還是調控基因的類型上都差別很大。通過反轉錄結合PCR發(fā)現(xiàn)CN1的這個基因簇與阿拉伯糖操縱子有很高的相似性，其兩個啟動子緊挨著位于基因簇中部，并在環(huán)己酮誘導的情況下向相反的方向轉錄。利用GC-MS驗證環(huán)己

5、醇脫氫酶和環(huán)己酮加氧酶的轉化功能，并且還發(fā)現(xiàn)在環(huán)己醇脫氫酶與環(huán)己酮加氧酶共表達的條件下，前者的活性遠遠高于后者。在大腸桿菌中異源表達了CN1的環(huán)己酮單加氧酶，發(fā)現(xiàn)大都形成了包涵體，通過稀釋復性從而獲得了有活性的酶。 通過構建了CN1環(huán)己酮單加氧酶及所有BVMO家族蛋白的三維結構模型，結合系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)BVMO家族蛋白中心相當保守，發(fā)現(xiàn)并推測一條保守的多肽對于酶的性質影響很大，不認同一些學者對BVMO催化中心的見解，提出了B

6、VMO蛋白有額外的底物結合區(qū)，和新的催化機理模型。 此外，通過組合碳源，富集培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)基等要素，從印度洋熱液口的一個泥樣中分離到30個屬的116株細菌，其中16株菌的16SRNA序列與網(wǎng)上比對的最高相似度低于或等于97％。通過GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)其中有19株可轉化環(huán)己酮，隨機選9株菌進行southern雜交驗證，發(fā)現(xiàn)這些菌中確實含有環(huán)己酮加氧酶。與已報道的篩菌方法相比不僅開創(chuàng)了新的環(huán)己酮降解菌的高效篩選方法，而且在一個泥樣