鉛對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元鈉電流的抑制作用

1、鉛對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元鈉電流的抑制作用杜正清，孟紫強(qiáng)（山西大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)與毒理學(xué)研究所，山西太原０３０００６）摘要：目的鉛對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有損害作用，鈉通道是神經(jīng)元產(chǎn)生和傳遞電信號(hào)的重要樞紐，故研究鉛對(duì)大鼠海馬ＣＡ１區(qū)神經(jīng)元鈉電流（ＩＮａ）的影響。方法全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)。結(jié)果醋酸鉛可濃度依賴地抑制ＩＮａ，１，１０，５０和１００μｍｏｌＬ－１醋酸鉛對(duì)ＩＮａ的抑制率分別為（８２０８）％，（２０９２６）％，（５１８４８）％和（６６４５７）％。此外，它還與

2、電壓呈依賴關(guān)系，５０μｍｏｌＬ－１醋酸鉛可使ＩＮａ的激活曲線顯著右移，但不改變斜率因子，還可使ＩＮａ的失活曲線顯著左移。結(jié)論鉛可抑制ＩＮａ的激活過(guò)程，可促進(jìn)ＩＮａ的失活過(guò)程。鉛改變了細(xì)胞膜的電壓感應(yīng)，這可能是鉛損傷海馬神經(jīng)元的作用機(jī)制之一。關(guān)鍵詞：海馬；神經(jīng)元；膜片鉗技術(shù)，全細(xì)胞；鉛；鈉通道中圖分類(lèi)號(hào)：Ｒ９９５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：１０００３００２（２００４）０１００６２０４鉛是環(huán)境中的一種有毒重金屬，可通過(guò)多種途徑進(jìn)入人體，對(duì)

3、人體造成多系統(tǒng)、多功能的損害。大量的研究表明，鉛可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損害作用［１］。阮迪云等［２］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鉛處理組大鼠海馬齒狀回興奮性突觸后電位和群峰電位誘導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)程突觸后電位增強(qiáng)的幅度均明顯低于對(duì)照組，同時(shí)齒狀回的雙脈沖易化反應(yīng)也受到損傷。研究還發(fā)現(xiàn)，鉛可對(duì)心臟產(chǎn)生損傷作用。王桂蘭等［３］報(bào)道，ＳＤ雄性大鼠每天用１０，３０，９０ｍｇｋｇ－１醋酸鉛ｉｇ９周，結(jié)果心臟細(xì)胞膜Ｎａ＋，Ｋ＋ＡＴＰ酶、超氧化物歧化酶活性收稿日期：２００３

4、０４０２接受日期：２００３０６１６基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（３０２３０３１０）作者簡(jiǎn)介：杜正清（１９７１－），女，山西大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)與毒理學(xué)研究所博士研究生，山西財(cái)經(jīng)大學(xué)講師，研究方向?yàn)榄h(huán)境醫(yī)學(xué)與毒理學(xué)聯(lián)系作者Ｅｍａｉｌ：ｚｑｍｅｎｇ＠ｓｘｕｅｄｕｃｎＴｅｌ／Ｆａｘ：８６３５１７０１１８９５降低，丙二醛含量、Ｃａ２＋ＡＴＰ酶活性升高，血鉛和尿鉛含量也增高。鉛能抑制機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能［４］。戴曉青等［５］

5、報(bào)道了鉛對(duì)背根神經(jīng)元鈉通道和鉀通道的影響，然而鉛對(duì)海馬神經(jīng)元鈉通道的影響還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本文利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究了鉛對(duì)大鼠海馬ＣＡ１區(qū)神經(jīng)元鈉離子通道的影響，以探討鉛對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的機(jī)制。１材料與方法１１動(dòng)物Ｗｉｓｔａｒ大鼠，鼠齡５～１０ｄ，♀♂不限，中國(guó)輻射防護(hù)研究院動(dòng)物房提供。１２試劑蛋白酶，ＨＥＰＥＳ，ＥＧＴＡ，Ｎａ２ＡＴＰ和醋酸鉛〔Ｐｂ（Ａｃ）２３Ｈ２Ｏ〕均為Ｓｉｇｍａ公司產(chǎn)品。標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液（ｍｍｏｌＬ－１）：ＮａＣｌ

6、１５０，ＫＣｌ５，ＭｇＣｌ２１１，ＣａＣｌ２２６，ＨＥＰＥＳ１０，葡萄糖１０，ｐＨ７４，記錄前加入ＣｄＣｌ２０２ｍｍｏｌＬ－１。電極內(nèi)液（ｍｍｏｌＬ－１）：ＣｓＣｌ７５，ＮａＦ７５，ＭｇＣｌ２２，ＨＥＰＥＳ１０，ＥＧＴＡ２５，Ｎａ２ＡＴＰ３，ｐＨ７５。１３大鼠海馬神經(jīng)元錐體細(xì)胞的急性分離大鼠斷頭取腦，置于０～４℃孵育液中分出海馬，切成４００～５００μｍ厚的腦片，置于３２℃孵育液中，連續(xù)通入Ｏ２，孵育３０ｍｉｎ。而后加入蛋白酶，使其終濃度

7、為０５ｇＬ－１，３２℃下消化３５ｍｉｎ。消化畢用孵育液洗腦片３次，投入盛有氧飽和標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液的離心管內(nèi)，用Ｐａｓｔｅｕｒ吸管輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液，靜置５ｍｉｎ。取上部細(xì)胞懸液，加入盛有氧飽和標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液的培養(yǎng)皿內(nèi)，１５ｍｉｎ后細(xì)胞貼壁，即可進(jìn)入全細(xì)胞膜片鉗記錄［６］。１４全細(xì)胞膜片鉗記錄及數(shù)據(jù)分析在２０～２５℃室溫下，利用Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ膜片鉗放大器（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＵＳＡ）進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄，記錄電極由玻璃

8、毛細(xì)管徑ＰＰ８３０型微電極拉制儀（Ｎａｒｒｉｓｈａｇｅ，Ｊａｐａｎ）拉制，充灌電極內(nèi)液后阻抗為２６中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００４年２月；２００４Ｆｅｂ；１８（１）：６２－６５１８（１）：６２－６５Ｆｉｇ３Ｅｆｆｅｃｔｏｆ５０μｍｏｌＬ－１Ｐｂ（Ａｃ）２ｏｎｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｓｔｅａｄｙｓｔａｔｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆＩＮａｉｎｈｉｐｐｏｃ

9、ａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓｏｆｒａｔｓ（Ａ）ＩＮａｗａｓｅｖｏｋｅｄｂｙ１２ｍｓｄｅｐｏｌａｒｉｚｉｎｇｐｕｌｓｅｓｆｒｏｍＨＰｏｆ－１００ｍＶｔｏ０ｍＶｉｎ１０ｍＶｓｔｅｐｓａｐｐｌｉｅｄａｔａｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆ０２５ＨｚＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｗｅｒｅｆｉｔｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅＢｏｌｔｚｍａｎｎｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｏｒｍ：Ｇ／Ｇｍａｘ＝１／｛１＋ｅｘｐ〔（Ｖ－Ｖｈ）／ｋ〕｝，ｗｈｅｒｅＧｍａｘｉｓｔｈｅｍａｘｉｍ

10、ａｌｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ，Ｖｈ，ｔｈｅｖｏｌｔａｇｅａｔｗｈｉｃｈｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓｈａｌｆａｃｔｉｖａｔｅｄ，ａｎｄｋｉｓｔｈｅｓｌｏｐｅｆａｃｔｏｒｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇｔｈｅｓｌｏｐｅｏｆｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓＢｅｆｏｒｅＰｂ（Ａｃ）２ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｈａｎｄｋｗｅｒｅ－（４２００６）ｍＶａｎｄ９００６，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＤｕｒｉｎｇ５０μｍｏｌＬ－１Ｐｂ（Ａｃ）２ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｈ

11、ａｎｄｋｗｅｒｅ－（３６１０５）ｍＶａｎｄ７２０５，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｂ）Ｃｕｒｒｅｎｔｓｗｅｒｅｅｌｉｃｉｔｅｄｂｙａｔｗｏｐｕｌｓｅｐｒｏｔｏｃｏｌ，ａ５００ｍｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｅｐｕｌｓｅｔｏｖａｒｉｏｕｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ（ｆｒｏｍ－１２０ｍＶｔｏ０ｍＶ）ｗａｓｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙａ１２ｍｓｄｅｐｏｌａｒｉｚｉｎｇｐｕｌｓｅｆｒｏｍ－１００ｍｓｔｏ－３０ｍＶａｐｐｌｉｅｄａｔａｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆ

12、０２５ＨｚＨＰ＝－１００ｍＶＳｔｅａｄｙｓｔａｔｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｗｅｒｅｆｉｔｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅＢｏｌｔｚｍａｎｎｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｏｒｍ：Ｉ／Ｉｍａｘ＝１／｛１＋ｅｘｐ〔（Ｖ－Ｖｈ）／ｋ〕｝，ｗｈｅｒｅＩｍａｘｉｓｔｈｅｍａｘｉｍａｌｃｕｒｒｅｎｔ，Ｖｈ，ｔｈｅｖｏｌｔａｇｅａｔｗｈｉｃｈｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓｈａｌｆｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ，ａｎｄｋｉｓｔｈｅｓｌｏｐｅｆａｃｔｏｒｄｅｓｃ

13、ｒｉｂｉｎｇｔｈｅｓｌｏｐｅｏｆｔｈｅｓｔｅａｄｙｓｔａｔｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓＢｅｆｏｒｅＰｂ（Ａｃ）２ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｈａｎｄｋｗｅｒｅ－（５４１０３）ｍＶａｎｄ６８０２，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＤｕｒｉｎｇ５０μｍｏｌＬ－１Ｐｂ（Ａｃ）２ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｈａｎｄｋｗｅｒｅ－（５８３０５）ｍＶａｎｄ９８０５，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ珋ｘｓ，ｎ＝１０－（５８３０５）ｍＶ（ｎ＝１０，Ｐ＜００５），ｋ

14、分別為６８０２和９８０５（ｎ＝１０，Ｐ＜００５）。由此可見(jiàn)，醋酸鉛可使ＩＮａ的失活曲線顯著左移，且改變其斜率因子。３討論神經(jīng)細(xì)胞膜電壓門(mén)控性鈉通道在神經(jīng)元的信號(hào)調(diào)控過(guò)程中具有十分重要的作用，同時(shí)它又是某些神經(jīng)毒素作用的靶點(diǎn)，這些毒素通過(guò)影響鈉通道的結(jié)構(gòu)和功能而發(fā)揮其對(duì)中樞神經(jīng)元的損傷效應(yīng)［５～７］。當(dāng)去極化刺激時(shí)，電壓門(mén)控鈉通道開(kāi)啟所形成的內(nèi)向ＩＮａ是產(chǎn)生神經(jīng)動(dòng)作電位上升相的必要條件和關(guān)鍵因素，因此，ＩＮａ的幅度是產(chǎn)生神經(jīng)信號(hào)的關(guān)鍵。本

15、實(shí)驗(yàn)證實(shí)了鉛降低ＩＮａ的幅度，抑制ＩＮａ的激活過(guò)程，促進(jìn)ＩＮａ的失活化過(guò)程。說(shuō)明了鉛損傷了神經(jīng)信號(hào)的產(chǎn)生和傳導(dǎo)過(guò)程，這一過(guò)程在鉛抑制神經(jīng)細(xì)胞鈣離子通道和鉀離子通道，從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用中起著一種輔助效應(yīng)。另外，電壓依賴性ＩＮａ的減小，會(huì)造成神經(jīng)元胞內(nèi)Ｃａ２＋濃度降低，從而抑制Ｎａ＋，Ｋ＋ＡＴＰ酶的活性，使得細(xì)胞難以超極化，不利于恢復(fù)到靜息電位。它會(huì)影響胞內(nèi)Ｋ＋濃度，加速能量的消耗［８］。胞內(nèi)正常水平的Ｋ＋濃度可抑制引起半胱天冬酶

16、３效應(yīng)的蛋白酶的激活和凋亡的ＤＮＡ斷裂；而胞內(nèi)Ｋ＋濃度的減小可激活半胱天冬酶和核酸酶，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［９］。另一方面，能量消耗的加速導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，使Ｃａ２＋ＡＴＰ酶的活性降低，Ｃａ２＋外流減小，由此引起鈣平衡機(jī)制的破壞，造成胞內(nèi)Ｃａ２＋水平持續(xù)增高，導(dǎo)致蛋白酶、磷脂酶和核酸內(nèi)切酶活化，引起蛋白質(zhì)、磷脂和ＤＮＡ損傷，而且還會(huì)啟動(dòng)耗能代償機(jī)制，導(dǎo)致與功能有關(guān)的系統(tǒng)紊亂［１０］。本研究結(jié)果表明，鉛可抑制大鼠海馬ＣＡ１區(qū)神經(jīng)元的ＩＮａ

17、的激活過(guò)程，促進(jìn)其失活過(guò)程，使胞內(nèi)的鈉離子濃度減小。分子的活動(dòng)是電壓門(mén)控通道的基本特征，在膜去極化時(shí)，會(huì)有快速激活的ＩＮａ產(chǎn)生；ＩＮａ的激活推遲可能是鉛快速且具有高度選擇性地進(jìn)入離子通道，結(jié)合跨膜蛋白氨基酸殘基，在空間位置上關(guān)閉電壓傳感器來(lái)影響門(mén)控電荷，從而誘導(dǎo)非正常狀態(tài)下的離子通道構(gòu)象，從而影響鈉內(nèi)流。鉛促使鈉離子通道失活可能是鉛結(jié)合氨基末端的離子通道蛋白，通過(guò)另一條氨基酸片段栓在通道的余留部分，進(jìn)而使通道提前失活。鉛的這一影響會(huì)使膜