鉛暴露引起的大鼠海馬神經(jīng)元細胞應激損傷反應機制研究.pdf

1、目的：重金屬鉛是一種普遍存在的環(huán)境神經(jīng)毒物,低濃度的慢性鉛暴露對嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損害以及對學習記憶能力的影響是一個備受關(guān)注的重大問題。嬰幼兒的消化道對鉛的吸收率較成人約高5倍,而排泄率較成人低,加之兒童血腦屏障發(fā)育不全,因此鉛極易在神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生蓄積。0～6歲兒童的大腦智力發(fā)育對鉛的敏感性高于成30倍,我國很多城市兒童鉛中毒已達到30～40％,是美國兒童的10余倍。研究表明當兒童的血鉛由0.48μmol/L升高到0.97μmol

2、/L時,智商平均下降2～6分。
　　 海馬是大腦學習和記憶的關(guān)鍵部位。海馬長時程增強(Long TermPotentiation,LTP)由于本身具有協(xié)同性、聯(lián)合性、特異性等特點,使它成為信息儲存和記憶的細胞機制。研究發(fā)現(xiàn),缺氧、低糖、重金屬等應激信號可以使海馬神經(jīng)元細胞受到損傷。當應激強度過大,海馬神經(jīng)元細胞功能嚴重受損時細胞將啟動生長抑制DNA損傷誘導因子(growth arrest and DNA damageinduci

3、ble gene,GADD153)等信號觸發(fā)細胞凋亡。
　　 大量的動物實驗研究表明,海馬是鉛損害大腦的主要作用靶點之一。細胞周期的調(diào)節(jié)是細胞生長階段的一個重要環(huán)節(jié)。許多細胞毒性和遺傳毒性因子可阻斷細胞周期并導致細胞死亡。研究表明,鉛是一種細胞毒性因子可引起不同類型的細胞產(chǎn)生細胞毒性。
　　 本實驗預在體外原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細胞中證明鉛可導致海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)及功能的損傷;探討鉛對海馬神經(jīng)元細胞DNA的損傷及其對細胞周

4、期的阻斷程度;以及鉛誘導cyclin D1的表達是通過何種信號途徑進行的以及這些信號途徑中的某些信號分子的改變,從而進一步探討鉛中毒時海馬神經(jīng)元細胞的變化對學習記憶損傷的影響機制。
　　 方法：
　　 1、Wistar大鼠腦海馬神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng),分別加入醋酸鉛培養(yǎng)不同時間及不同濃度,加入醋酸鈉作為對照。
　　 2、流式細胞技術(shù)分析醋酸鉛對海馬神經(jīng)元細胞的細胞周期進程的影響。
　　 3、MTT比色法觀察

5、醋酸鉛對海馬神經(jīng)元細胞增殖的影響。
　　 4、通過SOD、GSH-Px、CAT、TChE及MDA試劑盒檢測鉛對海馬神經(jīng)元細胞氧化應激水平的影響。
　　 5、Western blot方法檢測醋酸鉛誘導的CyclinD1和GADD153蛋白表達變化。
　　 6、彗星實驗檢測大鼠海馬原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞DNA損傷程度。
　　 7、倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。
　　 8、RT-PCR檢測GADD153的mRN

6、A表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、MTT比色法結(jié)果顯示:細胞經(jīng)染鉛處理后細胞增殖比明顯降低,且與鉛的水平呈時間依賴關(guān)系,10μM/L醋酸鉛處理細胞4天起,細胞增殖比下降具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2、流式細胞技術(shù)結(jié)果顯示:隨著染鉛濃度的增加,可觀察到有細胞阻斷情況發(fā)生。在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細胞S相過程中尤為顯著。如下圖所示,當原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞染鉛濃度為0.2μmol/L時,細胞周期阻斷情況不顯

7、著(sub-G1,S,G0/G1,and G2/M),當染鉛濃度增加到1.0μmol/L和and10μmol/L時,S和sub-G1期細胞周期阻斷情況顯著。
　　 3、Western blot結(jié)果顯示:
　　 (1)隨著染鉛濃度0.2,1.0和10μmol/L的增加,CyclinD1蛋白表達與對照組相比逐漸降低。從染鉛0.2μmol/L開始,CyclinD1蛋白表達下降有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),染鉛1.0和10μmo

8、l/L時,CyclinD1蛋白表達下降有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 (2)用Western blot方法檢測不同濃度染鉛組GADD153蛋白表達值:醋酸鉛終濃度分別為0.2、1.0、10μM/L。結(jié)果顯示只有10μM/L醋酸鉛誘導的GADD153蛋白表達增加具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 (3)10μM/L醋酸鉛呈時間依賴性刺激海馬神經(jīng)元細胞GADD153蛋白表達增加。醋酸鉛作用24 h后GADD15

9、3蛋白表達已經(jīng)開始升高,染鉛8天時達峰值。
　　 4、彗星實驗結(jié)果顯示:醋酸鉛組中的DNA的尾距(OTM)和彗尾值(％tail)相比對照組,醋酸鉛1.0和10μmol/K組明顯高(P＜0.05)。醋酸鉛0.2μmol/L組的彗尾高于對照組,差異無顯著性意義(P＞0.05)。
　　 5、石墨爐原子吸收法結(jié)果顯示:
　　 (1)醋酸鈉對照組海馬神經(jīng)元細胞GADD153純化產(chǎn)物中鉛含量無明顯改變;
　　 (2)

10、與對照組相比,10μM/L醋酸鉛處理的海馬神經(jīng)元細胞的GADD153純化產(chǎn)物中鉛含量的改變趨勢與GADD153蛋白表達的改變趨勢相同。醋酸鉛作用12 h時純化產(chǎn)物中鉛含量已經(jīng)開始升高,染鉛8天時達峰值。
　　 6、原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細胞的過氧化損傷檢測結(jié)果顯示:
　　 (1)染鉛后海馬神經(jīng)元細胞SOD活力檢測結(jié)果顯示出不同濃度醋酸鉛作用海馬神經(jīng)元細胞12h后,各染毒組與對照組比較SOD活性分別下降35.6％、47.8

11、％、52.2％和56.7％,組間比較差異不顯著(P＞0.05);
　　 (2)染鉛后海馬神經(jīng)元細胞GSH-Px活力檢測結(jié)果顯示出不同濃度醋酸鉛作用海馬神經(jīng)元細胞12h后,各染毒組與對照組比較,GSH-Px活性均顯著降低(P＜0.05),與對照組比較,從低劑量到高劑量,各染毒組GSH-Px活性分別下降17.6％、25.5％、37.8％和46.2％,組問差異顯著(P＜0.05);
　　 (3)染鉛后海馬神經(jīng)元細胞CAT活力檢

12、測結(jié)果顯示出不同濃度醋酸鉛作用海馬神經(jīng)元細胞12h后,各染毒組與對照組比較,CAT活性含量則顯著升高(P＜0.05)。與對照組比較,從低劑量到高劑量,各染毒組CAT活性分別升高27.8％、63.8％、112.5％和117.8％,當鉛作用濃度在200μmol/L以下時,組間差異顯著(P＜0.05),而在200μmol/L以上時組間表現(xiàn)差異不顯著(P＞0.05);
　　 (4)染鉛后海馬神經(jīng)元細胞TChE活力檢測結(jié)果顯示出不同濃度醋

13、酸鉛作用海馬神經(jīng)元細胞12h后,各染毒組與對照組比較,TChE活性分別下降22.5％、37.4％、42.9％和53.7％,組間比較有顯著差異(P＜0.05);
　　 (5)染鉛后海馬神經(jīng)元細胞MDA活力檢測結(jié)果顯示出不同濃度醋酸鉛作用海馬神經(jīng)元細胞12h后,各染毒組與對照組比較,MDA含量則顯著升高。與對照組比較,從低劑量到高劑量,MDA含量分別升高了54.9％、117.2％、322.5％和342.7％(P＜0.05或P＞0.0

14、5)。
　　 7、RT-PCR檢測GADD153的mRNA表達結(jié)果顯示:與對照組相比,10μM/L醋酸鉛呈時間依賴性刺激海馬神經(jīng)元細胞GADD153 mRNA表達增加。醋酸鉛作用12 h時GADD153 mRNA表達已經(jīng)開始升高(為對照的1.58倍),染鉛24h時達峰值(為對照組的2.16倍)。
　　 結(jié)論：
　　 1、染鉛后海馬神經(jīng)元細胞SOD活性下降,染鉛后海馬神經(jīng)元細胞GSH-Px活性顯著降低,染鉛后海馬神

15、經(jīng)元細胞CAT活力含量則顯著升高,染鉛后海馬神經(jīng)元細胞TChE活力顯著下降,染鉛后海馬神經(jīng)元細胞MDA活力含量則顯著升高。
　　 2、在原代培養(yǎng)的鼠海馬神經(jīng)元細胞中,鉛進入海馬神經(jīng)元細胞后可抑制細胞增殖,鉛進入海馬神經(jīng)元細胞后可改變正常細胞形態(tài)和數(shù)量,可使海馬神經(jīng)元細胞的細胞周期停滯在G1期,并可抑制CyclinD1蛋白表達。
　　 3、鉛進入海馬神經(jīng)元細胞后可誘導GADD153大量表達,進入海馬神經(jīng)元細胞后可使其發(fā)生D