米諾環(huán)素對硝普鈉誘導的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的抑制作用.pdf

1、一、研究背景 海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分。在功能和纖維聯(lián)系上，不僅與嗅覺有關，更與學習記憶、內(nèi)臟活動、情緒反應、性活動、內(nèi)分泌以及生物節(jié)律的調(diào)節(jié)密切相關[1][2]。隨著科學研究手段的不斷進步，海馬結(jié)構的異常，尤其是海馬神經(jīng)元凋亡被發(fā)現(xiàn)是構成許多嚴重疾病的一種重要病理基礎。 研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，如老年性癡呆(Alzheimer disease，AD)，其特征性的病理變化之一是腦內(nèi)神經(jīng)元(尤其基底前腦和

2、海馬區(qū))數(shù)目明顯減少。而細胞凋亡活動過盛可能是其漸進性神經(jīng)退變的重要原因之一；大鼠血管性癡呆(vascular dementia，VD)模型中海馬CA1、CA3區(qū)的神經(jīng)細胞凋亡率隨時間延長逐漸增加，海馬區(qū)Caspase-3、NMDAR1-mRNA的表達顯著改變，被認為是導致認知障礙的一種重要病理學基礎瞄；海馬硬化是顳葉癲癇最常見的一類病理類型，其主要表現(xiàn)為神經(jīng)元脫失和膠質(zhì)細胞增生。癲癇發(fā)作后24 h，海馬CA3和CA4區(qū)出現(xiàn)大量凋亡神經(jīng)

3、元。目前許多研究認為，神經(jīng)元凋亡既是導致海馬硬化，癲癇頻發(fā)、難治以及致殘的原因，又是癲癇發(fā)作的結(jié)果。但到目前為止，這些以海馬神經(jīng)元凋亡為重要病理基礎的嚴重疾病均尚無特別有效的治療方案。要能尋找到一種既能有效抑制海馬神經(jīng)元凋亡，又易透過血腦屏障的藥物，無疑給這些人類治療棘手的疾病帶來新的希望。 米諾環(huán)素(minocycline)作為第二代半合成的四環(huán)類廣譜抗生素，在臨床上已經(jīng)應用了近40年。從1994年開始，Clark及Koist

4、inaho等相繼發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素對兔和鼠的腦缺血模型具有神經(jīng)保護作用，之后米諾環(huán)素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用逐漸被引起重視。大量研究表明，米諾環(huán)素在諸如：腦缺氧、亨停頓病、肌萎縮側(cè)索硬化、帕金森氏病、多發(fā)性硬化、腦外傷、癲癇、精神分裂癥、脊髓損傷等許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體內(nèi)、外動物模型中都顯示出明顯的神經(jīng)保護效應。尤其對細胞凋亡抑制作用顯著。同時米諾環(huán)素具有高親脂性，極易通過血腦屏障，口服胃腸道吸收好，長期使用人體耐受性好，副作用小等獨特優(yōu)點。

5、 基于以上理論基礎及研究成果，我們設計了該課題，研究米諾環(huán)素對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元凋亡是否有抑制作用?旨在為AD、VD、顳葉癲癇等各種以海馬神經(jīng)元凋亡為病理基礎的疾病探索可能的新防治方案。 二、研究目的 1.體外分離培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細胞，并用硝普鈉誘導其凋亡，構建體外神經(jīng)細胞的凋亡模型。 2.明確米諾環(huán)素是否對海馬神經(jīng)元凋亡具有抑制作用。 3.明確該種抑制作用是否具有劑量依賴性。 4.明確該種

6、抑制作用是否具有超早期和遲發(fā)效應之分。 5.若有抑制作用，進一步討論米諾環(huán)素對海馬神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生抑制作用的可能機制。 三、實驗對象及方法 (一)實驗對象出生1—3天的SD大鼠腦。 (二)實驗方法 1.四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測： ①細胞分組：將培養(yǎng)7天的原代海馬神經(jīng)元細胞隨機分為4組：1)正常組：除了細胞培養(yǎng)液未進行任何藥物干預；2)單純SNP組：更換細胞培養(yǎng)液后，加用硝普鈉作用24h

7、；3)單純Mino組：更換細胞培養(yǎng)液后，各自用不同濃度0.002、0.02、0.2、2、20umol／L的米諾環(huán)素單獨處理細胞24h。4)SNP+Mino組：在3)組的基礎上更換細胞培養(yǎng)液，再用硝普鈉作用24h。 ②處理：按上述細胞分組處理細胞后，每類樣本設6孔，每孔加MTT溶液(5 g／L)20 μl，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲亞砜(DMSO)，振蕩15min，至晶體顆粒溶解，在酶標儀上測定595nm的

8、吸光度，計算細胞存活率。 2.流式細胞儀檢測細胞凋亡： ①細胞分組：將原代培養(yǎng)7天的海馬神經(jīng)元隨機分4組：1)正常組：除了細胞培養(yǎng)液未進行任何藥物干預；分別于3天和7天時觀察結(jié)果；2)對照組(單純硝普鈉組)：先加入凋亡誘導劑硝普鈉處理24 h，然后更換正常培養(yǎng)基，分別于3天和7天觀察結(jié)果。3)預防組：先加入不同濃度的米諾環(huán)素注射液作用后，細胞分2批，分別于3天和7天時，再加用硝普鈉干預細胞24h；4)治療組：加用硝普鈉

9、作用細胞24h，誘導神經(jīng)元凋亡，再細胞分2批，分別加入不同濃度的米諾環(huán)素注射液作用3、7天。 (米諾環(huán)素分別用0.002、0.02、0.2、2umol／L的濃度進行干預)。 ②處理：按照上述分組處理細胞后，PBS漂洗，然后用O．125％胰蛋白酶消化貼壁細胞，接著低速離心(500 r／min，10 min)后，加入Annexin V—FITC和PI染液重懸細胞，室溫避光溫育10分鐘，HEPES洗滌后過濾上機檢測，分析結(jié)果。

10、 3.Tunel檢測細胞凋亡 按照上述2①同樣的分組方案處理細胞后，棄培養(yǎng)液，用4％多聚甲醛固定細胞，接著按照Tunel試劑盒的說明進行操作。染色后在顯微鏡下觀察：計算凋亡指數(shù)。 四、實驗結(jié)果 1.MTT檢測米諾環(huán)素產(chǎn)生細胞毒性的濃度滴定 ①米諾環(huán)素在0.002～2umol／L濃度范圍時，對細胞活性無明顯毒性。②達到20umol／L時，米諾環(huán)素具有細胞毒性，細胞活性僅43.229％±4.075％。③用0.

11、002～2umol／L米諾環(huán)素分別預處理細胞后，再用硝普鈉作用細胞，細胞活性隨著米諾環(huán)素預處理濃度的升高而升高，存在量效關系，比單純SNP組的細胞活性明顯增加，但仍低于正常組細胞活性。 2.流式細胞儀檢測凋亡 ①預防組和治療組的細胞凋亡率介于相同時間點正常組與對照組的細胞凋亡率之間；且米諾環(huán)素濃度為0.2umol／L時的細胞凋亡率，最低。②治療組細胞凋亡率比預防組的明顯降低。③各組3天點細胞凋亡率明顯低于7天點的值。

12、 3.Tunel從形態(tài)上檢測神經(jīng)元凋亡情況正常組未見TUNEL陽性細胞，對照組TUNEL陽性細胞基本上布滿整個視野。和正常組統(tǒng)計學差異顯著(p<0.05)。 米諾環(huán)素干預后，預防組和治療組的TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量介于相同時間點的正常組和對照組之間；且在米諾環(huán)素采用0.2umol／L時，陽性神經(jīng)元數(shù)量最少。與硝普鈉組比較，P<0.05： 五、實驗結(jié)論 1.對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細胞，米諾環(huán)素為0.002～2u