米諾環(huán)素對硝普鈉誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的抑制作用.pdf

1、一、研究背景 海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分。在功能和纖維聯(lián)系上，不僅與嗅覺有關(guān)，更與學(xué)習(xí)記憶、內(nèi)臟活動、情緒反應(yīng)、性活動、內(nèi)分泌以及生物節(jié)律的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[1][2]。隨著科學(xué)研究手段的不斷進(jìn)步，海馬結(jié)構(gòu)的異常，尤其是海馬神經(jīng)元凋亡被發(fā)現(xiàn)是構(gòu)成許多嚴(yán)重疾病的一種重要病理基礎(chǔ)。 研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，如老年性癡呆(Alzheimer disease，AD)，其特征性的病理變化之一是腦內(nèi)神經(jīng)元(尤其基底前腦和

2、海馬區(qū))數(shù)目明顯減少。而細(xì)胞凋亡活動過盛可能是其漸進(jìn)性神經(jīng)退變的重要原因之一；大鼠血管性癡呆(vascular dementia，VD)模型中海馬CA1、CA3區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率隨時間延長逐漸增加，海馬區(qū)Caspase-3、NMDAR1-mRNA的表達(dá)顯著改變，被認(rèn)為是導(dǎo)致認(rèn)知障礙的一種重要病理學(xué)基礎(chǔ)瞄；海馬硬化是顳葉癲癇最常見的一類病理類型，其主要表現(xiàn)為神經(jīng)元脫失和膠質(zhì)細(xì)胞增生。癲癇發(fā)作后24 h，海馬CA3和CA4區(qū)出現(xiàn)大量凋亡神經(jīng)

3、元。目前許多研究認(rèn)為，神經(jīng)元凋亡既是導(dǎo)致海馬硬化，癲癇頻發(fā)、難治以及致殘的原因，又是癲癇發(fā)作的結(jié)果。但到目前為止，這些以海馬神經(jīng)元凋亡為重要病理基礎(chǔ)的嚴(yán)重疾病均尚無特別有效的治療方案。要能尋找到一種既能有效抑制海馬神經(jīng)元凋亡，又易透過血腦屏障的藥物，無疑給這些人類治療棘手的疾病帶來新的希望。 米諾環(huán)素(minocycline)作為第二代半合成的四環(huán)類廣譜抗生素，在臨床上已經(jīng)應(yīng)用了近40年。從1994年開始，Clark及Koist

4、inaho等相繼發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素對兔和鼠的腦缺血模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，之后米諾環(huán)素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用逐漸被引起重視。大量研究表明，米諾環(huán)素在諸如：腦缺氧、亨停頓病、肌萎縮側(cè)索硬化、帕金森氏病、多發(fā)性硬化、腦外傷、癲癇、精神分裂癥、脊髓損傷等許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體內(nèi)、外動物模型中都顯示出明顯的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。尤其對細(xì)胞凋亡抑制作用顯著。同時米諾環(huán)素具有高親脂性，極易通過血腦屏障，口服胃腸道吸收好，長期使用人體耐受性好，副作用小等獨特優(yōu)點。

5、 基于以上理論基礎(chǔ)及研究成果，我們設(shè)計了該課題，研究米諾環(huán)素對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元凋亡是否有抑制作用?旨在為AD、VD、顳葉癲癇等各種以海馬神經(jīng)元凋亡為病理基礎(chǔ)的疾病探索可能的新防治方案。 二、研究目的 1.體外分離培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，并用硝普鈉誘導(dǎo)其凋亡，構(gòu)建體外神經(jīng)細(xì)胞的凋亡模型。 2.明確米諾環(huán)素是否對海馬神經(jīng)元凋亡具有抑制作用。 3.明確該種抑制作用是否具有劑量依賴性。 4.明確該種

6、抑制作用是否具有超早期和遲發(fā)效應(yīng)之分。 5.若有抑制作用，進(jìn)一步討論米諾環(huán)素對海馬神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生抑制作用的可能機(jī)制。 三、實驗對象及方法 (一)實驗對象出生1—3天的SD大鼠腦。 (二)實驗方法 1.四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測： ①細(xì)胞分組：將培養(yǎng)7天的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為4組：1)正常組：除了細(xì)胞培養(yǎng)液未進(jìn)行任何藥物干預(yù)；2)單純SNP組：更換細(xì)胞培養(yǎng)液后，加用硝普鈉作用24h

7、；3)單純Mino組：更換細(xì)胞培養(yǎng)液后，各自用不同濃度0.002、0.02、0.2、2、20umol／L的米諾環(huán)素單獨處理細(xì)胞24h。4)SNP+Mino組：在3)組的基礎(chǔ)上更換細(xì)胞培養(yǎng)液，再用硝普鈉作用24h。 ②處理：按上述細(xì)胞分組處理細(xì)胞后，每類樣本設(shè)6孔，每孔加MTT溶液(5 g／L)20 μl，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲亞砜(DMSO)，振蕩15min，至晶體顆粒溶解，在酶標(biāo)儀上測定595nm的

8、吸光度，計算細(xì)胞存活率。 2.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡： ①細(xì)胞分組：將原代培養(yǎng)7天的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分4組：1)正常組：除了細(xì)胞培養(yǎng)液未進(jìn)行任何藥物干預(yù)；分別于3天和7天時觀察結(jié)果；2)對照組(單純硝普鈉組)：先加入凋亡誘導(dǎo)劑硝普鈉處理24 h，然后更換正常培養(yǎng)基，分別于3天和7天觀察結(jié)果。3)預(yù)防組：先加入不同濃度的米諾環(huán)素注射液作用后，細(xì)胞分2批，分別于3天和7天時，再加用硝普鈉干預(yù)細(xì)胞24h；4)治療組：加用硝普鈉

9、作用細(xì)胞24h，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，再細(xì)胞分2批，分別加入不同濃度的米諾環(huán)素注射液作用3、7天。 (米諾環(huán)素分別用0.002、0.02、0.2、2umol／L的濃度進(jìn)行干預(yù))。 ②處理：按照上述分組處理細(xì)胞后，PBS漂洗，然后用O．125％胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，接著低速離心(500 r／min，10 min)后，加入Annexin V—FITC和PI染液重懸細(xì)胞，室溫避光溫育10分鐘，HEPES洗滌后過濾上機(jī)檢測，分析結(jié)果。

10、 3.Tunel檢測細(xì)胞凋亡 按照上述2①同樣的分組方案處理細(xì)胞后，棄培養(yǎng)液，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，接著按照Tunel試劑盒的說明進(jìn)行操作。染色后在顯微鏡下觀察：計算凋亡指數(shù)。 四、實驗結(jié)果 1.MTT檢測米諾環(huán)素產(chǎn)生細(xì)胞毒性的濃度滴定 ①米諾環(huán)素在0.002～2umol／L濃度范圍時，對細(xì)胞活性無明顯毒性。②達(dá)到20umol／L時，米諾環(huán)素具有細(xì)胞毒性，細(xì)胞活性僅43.229％±4.075％。③用0.

11、002～2umol／L米諾環(huán)素分別預(yù)處理細(xì)胞后，再用硝普鈉作用細(xì)胞，細(xì)胞活性隨著米諾環(huán)素預(yù)處理濃度的升高而升高，存在量效關(guān)系，比單純SNP組的細(xì)胞活性明顯增加，但仍低于正常組細(xì)胞活性。 2.流式細(xì)胞儀檢測凋亡 ①預(yù)防組和治療組的細(xì)胞凋亡率介于相同時間點正常組與對照組的細(xì)胞凋亡率之間；且米諾環(huán)素濃度為0.2umol／L時的細(xì)胞凋亡率，最低。②治療組細(xì)胞凋亡率比預(yù)防組的明顯降低。③各組3天點細(xì)胞凋亡率明顯低于7天點的值。

12、 3.Tunel從形態(tài)上檢測神經(jīng)元凋亡情況正常組未見TUNEL陽性細(xì)胞，對照組TUNEL陽性細(xì)胞基本上布滿整個視野。和正常組統(tǒng)計學(xué)差異顯著(p<0.05)。 米諾環(huán)素干預(yù)后，預(yù)防組和治療組的TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量介于相同時間點的正常組和對照組之間；且在米諾環(huán)素采用0.2umol／L時，陽性神經(jīng)元數(shù)量最少。與硝普鈉組比較，P<0.05： 五、實驗結(jié)論 1.對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，米諾環(huán)素為0.002～2u