微生物與基因工程

1、第 十 章 微生物與基因工程,基因工程技術,基因工程（genetic engineering)：把分離到的或合成的基因經過改造，插入載體中，導入宿主細胞內，使其擴增和表達，從而得到大量基因產物，或令生物表現(xiàn)出新的形狀。,基因工程大事記,1973 Cohen和Boyer第一次將重組體DNA轉化大腸桿菌，實現(xiàn)了DNA的分子克隆;1978 Genentech公司---人胰島素---世界上第一種基因工程蛋白藥物 1982 第一個基

2、因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準使用 1985 第一批轉基因家畜（兔、豬和羊），中國 轉基因魚,1993 基因工程西紅柿在美國上市2019 英國羅斯林研究所-克隆羊多莉2019.9 中國獲準加入人類基因組計劃, 負責測定人類基因組全部序列的1%2000.6.26 科學家公布人類基因組工作草圖2019.2.11 公布人類基因組基本信息,第一節(jié) 基因工程概述,三項重要技術為基因工程奠定

3、了基礎:1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內切酶為基因工程提供了有力的工具；1972年Berg等將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功；1973年Cohen和Boyer第一次將重組體DNA轉化大腸桿菌，實現(xiàn)了DNA的分子克隆; 1977年Boyer等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽；1975-1977年Sanger、

4、Maxam和Gilbert先后發(fā)明了三種DNA序列的快速測定法；90年代全自動核酸序列測定儀的問世；,一、基因工程基本過程,1、目的基因的提取：分離或合成外源基因。2、體外重組：外源基因與載體體外連接，構建重組DNA分子；3、轉化：重組DNA分子導入細胞。4、擴增該克隆DNA。5、篩選與鑒定；6、基因表達：控制適當條件，外源DNA表達。7. 獲得表達產物或轉基因動物、轉基因植物。,一切基因工程操作都離不開微生物1、基因工程

5、所用克隆載體主要是用病毒、噬菌體和質粒改造而成的。2、基因工程所用千余種工具酶是從微生物中得到的。3、微生物細胞是基因克隆的宿主。4、大規(guī)模表達基因產物，構建工程菌，利用工廠發(fā)酵來實現(xiàn)。5、提供基因資源（抗高溫、高鹽、高堿、低溫等特性）。6、模式生物提供基礎理論。,二、微生物與基因工程關系,第二節(jié) 基因的分離合成和誘變,利用重組DNA技術，可將某一原核生物或真核生物染色體基因組的全部遺傳信息，貯存在由重組體群體（如重組噬菌體群

6、體）構成的基因文庫(genomic library)或cDNA文庫(cDNA library),1. 基因文庫的構建,所謂基因文庫是指生物染色體基因組各DNA片段的克隆總體。文庫中的每一個克隆只含基因組中某一特定的DNA片段。一個理想的基因文庫應包括該生物染色體基因組全部遺傳信息（即全部DNA序列）。,2、基因文庫的構建步驟：（1）從組織或細胞提取基因組DNA；（2）用限制性酶部分水解或機械剪切成適當長度的DNA　　　　　 片段

7、，經分級分離選出一定大小合適克隆的DNA片 　　　　　 段；（3）選擇容載量較大的克隆載體，通常采用λ噬菌體或　　　　　 柯斯質粒載體，在適當位點將載體切開；（4）將基因組DNA片段與載體進行體外連接；（5）重組體DNA直接轉化細菌或用體外包裝的重組λ噬　　　　　 菌體顆粒感染敏感細菌細胞。最后得到攜帶重組 　　　　 DNA的細菌群體或噬菌體群體即構成基因文庫。,2. c

8、DNA文庫構建,所謂cDNA文庫是指生物體全部mRNA的cDNA克隆總體。cDNA文庫中的每一個克隆只含一種mRNA信息。由于真核生物基因組十分龐大，因此要求構建基因文庫的庫容量要足夠大，才能篩選到某一目的基因。但基于這樣一個事實，即細胞中的mRNA分子數(shù)要比基因組的基因數(shù)小得多（通常大約僅有15%左右基因被表達），因而若由mRNA逆轉錄為cDNA，那么所構建的cDNA文庫的庫容量相應比基因文庫小。,構建cDNA文庫的主要步驟：①從

9、生物體或細胞中提取mRNA。②利用逆轉錄酶以寡聚(dT)或隨機寡聚核苷酸為引物合成cDNA的第一條鏈。③利用DNA聚合酶I，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當引物合成cDNA第二條鏈;常用RNA酶H在雜交分子的mRNA鏈上造成切口和缺口，產生一系列RNA引物;或是除去雜交分子的mRNA后，加入隨機引物，即可合成第二條鏈。④cDNA與載體的體外連接。⑤噬菌體的體外包裝及感染或質粒的轉化。由于cDNA不含基因的啟動子和內含子，因而序

10、列比基因短，其克隆載體可選用質?；虿《据d體。,基因的化學合成,DNA 的合成 自 DNA 合成儀問世后，化學合成已可完全自動化，在半個小時內可合成 30~35 個堿基的寡核苷酸。目前化學合成寡核苷酸片段的長度約為 150~200 個核苷酸左右。,PCR 擴增技術的原理和應用,聚合酶鏈式反應（ polymerase chain reaction, PCR ），是一種在體外快速擴增特定 DNA 序列的新技術。bbioo/video/2

11、019/351.htm,如果 DNA 片段兩端的序列是已知的，則先要合成一對寡聚核苷酸引物，它們各自與所需擴增的靶 DNA 片段的末端互補。 PCR 由 3 個基本反應組成。 ① 變性: 加熱，模板 DNA 經熱變性，成為兩條單鏈； ② 退火: 使溫度下降，寡核苷酸引物即與模板 DNA 中所要擴增序列兩端的堿基配對； ③ 延伸: 在適宜條件下引物 3‘ 端向前延伸，合成與模板堿基序列完全互補的 DNA 鏈。DNA 片段以 2 的指數(shù)

12、增長，重復 25~30 次循環(huán)，擴增的 DNA 片段拷貝數(shù)可增至 10 6 -10 7 倍。,PCR 擴增技術原理,PCR 技術的實際用途,① 可用于 DNA 的擴增和克隆，制備單鏈或雙鏈 DNA 探針；也可用于定位誘變和 DNA 測序。 ② 在臨床醫(yī)學上可用于檢測病原體，診斷遺傳病，以及對癌基因的分析確定。 ③用于法醫(yī),以鑒別個體和判定親緣關系。,基因誘變,寡核苷酸介導的突變 盒式誘變 　PCR介導的突變,第三節(jié)　微生物

13、與克隆載體,載體：克隆載體、表達載體、穿梭載體克隆載體：外源DNA片段進行克隆，需要一個合適的載體，將其運送到細胞中并進行復制與擴增。這種以擴增外源DNA為目的載體，稱為克隆載體。,克隆載體應具備的性質,1、可獨立自主復制，具備復制原點；2、具有若干限制酶單一切割位點，且位于載體復制的非必需區(qū)，以便插入外源基因后不影響復制。3、有可供選擇的遺傳標記（抗性基因、顯色反應），以便于對陽性克隆的鑒別和篩選。4、具有一定安全性，在胞內不

14、發(fā)生重組與轉移，在胞外不發(fā)生不能自由擴散。,目前克隆載體種類,質粒載體λ噬菌體載體柯斯質粒載體M13噬菌體載體真核細胞的克隆載體人工染色體。,一、質粒載體,1、特點：（1）具有獨立復制起點；（2）具有較小的相對分子質量。1－200kb，外源DNA≤15kb；（3）具有較高拷貝數(shù)，多為松馳控制型。人為增加拷貝數(shù)可用終濃度10－20μg/ml，氯霉素停止細胞蛋白合成，宿主DNA合成終止，質粒復制正常進行，可達數(shù)千個拷貝；（

15、4）具有便于選擇的標記；（5）易于導入細胞，質粒可通過轉化和電穿孔等方法導入細胞；（6）具有限制酶單一識別位點。,pBR322的結構特征,環(huán)狀雙鏈DNA分子，由4361bp組成，松馳型;colEⅠ復制起點，外源DNA大小為5kb左右;四環(huán)素抗性基因（Tetr）、氨芐青霉素抗性基因（Ampr）;24單一酶切位點（ Tetr中7個， Ampr中3個）。,二、λ噬菌體克隆載體,λ噬菌體克隆載體的構建,野生型λDNA包裝的上限為50.

16、5kb，本身長度為48.5kb，插入片段至多為2.0kb，如果將其縮短便能夠提高裝載量。插入型載體在插入位點有一酶切口，但這必須是唯一的；取代型載體在取代位點有兩個酶切口，多了也不行，而天然的λDNA上有許多重復的酶切口，如：EcoRI 5個，HindIII 7個，這些多余的酶切口必須被刪除,I 插入型載體,經改造后的長度為37kb，為包裝的下限，插入片段最大為13.5kb（50.5-37kb）由于該類載體重組與否均可包裝，因而為區(qū)

17、分組子與非重組子必須攜帶標記基因。,II 取代型載體,經改造后的長度約為40kb，含兩個酶切口，兩者間的距離為14kb，然后用外源DNA片段取代之。包裝下限為37kb，這類載體不需要標記基因，因為空載的載體DNA只有26kb，不可能被包裝，因而無法進入受體細胞中去。,λ噬菌體載體的優(yōu)點,可在體外包裝成噬菌體，高效感染大腸桿菌裝載外源DNA的量大（≤23kb）重組λ-DNA的篩選提取方便λ噬菌體載體常用于構建基因文庫。,三、 M1

18、3噬菌體載體,1、 M13 噬菌體基本特點：（1） M13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細胞，而是從感染的細胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細胞仍能繼續(xù)生長和分裂；（2） M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA ，由 6407 的堿基組成 ；（3）在宿主細胞內，感染性的單鏈噬菌體 DNA （正鏈）在宿主酶的作用下轉變成環(huán)狀雙鏈 DNA ，用于 DNA 的復制，因此這種雙鏈 DNA 稱為復制型 DNA （re

19、plicative form DNA） ，即 RF DNA ；,利用真核生物作為克隆載體宿主具有兩個重要意義。第一，它促進了對真核生物復雜基因組及其基因調控的研究；第二，它有利于真核基因產物的翻譯后加工。釀酒酵母是一種理想的真核生物克隆載體宿主。,四、真核生物的克隆載體,1.酵母質粒載體酵母質粒載體都是利用其2μm質粒和其酵母染色體組分與細菌質粒pBR322構建而成的。可分別在細菌、酵母中復制，又稱穿梭質粒。主要有三種：

20、附加體質粒、復制質粒、整合質粒,,（1）附加體質粒（episomal plasmid）,① 結構：pBR322的復制起點、Ampr（氨芐青霉素抗性基因）；2μm的復制起點；酵母選擇標記的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3）。② 細胞中拷貝數(shù)：酵母中高拷貝數(shù)。,（2）復制質粒,含有：來自細菌質粒pBR322的復制起點；氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）。來自酵母染色體的自主復制序列（ARS）；作為酵母選擇標

21、記的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1）。這種質粒是穿梭質粒，能在大腸桿菌或酵母細胞中復制，重組質粒導入酵母細胞中可獲得中等拷貝數(shù)的質粒。,（3）整合質粒,含有：來自pBR322的復制起點；氨芐青霉素抗性基因（Ampr）、四環(huán)素抗性基因（Tetr）。來自酵母的URA3基因；它既可以作為酵母細胞的選擇標記，也可與酵母染色體DNA進行同源重組。這種質?？稍诖竽c桿菌中復制，但不能在酵母細胞中進行自主復制。一旦導入酵母細胞，可整

22、合到酵母染色體上，成為染色體DNA的一個片段。,2.真核生物病毒載體,（1）哺乳動物病毒載體：目前利用許多哺乳動物病毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒等改造后的衍生物作為基因載體。（2）昆蟲病毒載體：主要為高克隆容量（100kb）；其次具有高表達效率（25％）；安全，僅感染無脊椎動物；（3）植物病毒載體,五、人工染色體,酵母人工染色體（YAC）：能容納最大外源DNA片段。1、組成：著絲粒（centromere，CEN）、端

23、粒（telomere， TEL）、酵母自主復制序列（ARS）、選擇性標記（如URA3）。2、功能：大片段克?。?00萬bp），多用于真核生物基因庫的載體。3、相關：細菌人工染色體（BAC）。,常用工具酶種類 內切酶 把DNA長鏈切割為短的片段 連接酶 將2段DNA片段拼接起來 聚合

24、酶 催化合成形成核酸鏈 末端轉移酶 片段末端加接多聚核苷酸 核酸酶 水解酶，非專一性 反向轉錄酶 逆轉錄酶,第四節(jié)　微生物與基因工程工具酶,一、限制性內切酶,1、限制性內切酶的定義 是指已被證明是限制修飾系統(tǒng)中的一個組成部分，具有識別雙鏈DNA分子中的某種特定核酸序列并由此切割DNA雙鏈結構的酶統(tǒng)稱

25、為限制性內切酶。,限制性內切酶的發(fā)現(xiàn),Luria和Human發(fā)現(xiàn)細菌能將外來的DNA片段在某些專一位點上切斷，從而保證其不被外來噬菌體所感染，而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾（甲基化）而得以保護，這種現(xiàn)象叫做限制－修飾。Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到一種酶，能夠特異性的切割DNA，這個酶被命名為Hind I,這是第一個分離到的限制性內切核酸酶。,3、限制性核酸內切酶的命名,按酶來源菌的屬、種名而定，取屬名的第一

26、個字母與種名的頭兩個字母組成的三個斜體字母作略語表示；如有株名，再加上一個字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。,4、限制性內切酶的類型,限制性內切酶可分為三大類型：類型I和類型III ：由于識別位點并非嚴格專一，很少被應用。類型II的特點: 識別位點嚴格專一；識別序列的堿基數(shù)一般為4

27、、6、8個bp；識別位點經常是一種回文序列的DNA；是DNA重組技術最為常用的工具酶。,寡核苷酸順序具有二沖旋轉對稱軸，又稱為回文順序（palindromic sequence） GAA TTC CTT AAG也有一些對稱順序被一個或幾個非特定的核苷酸間隔開。N-四種均可 Py-嘧啶 Pu-嘌呤如GTPyPuAC Hind I,6、限制性內切酶的切割方式,

28、就切割位點相對于對稱軸的位置而言,切割方式有三種:在對稱軸5' 側切割產生5' 粘端在對稱軸3' 側切割產生3' 粘端在對稱軸處切割產生平端,二、DNA連接酶,配對的堿基產生的氫鍵還不足以把兩個DNA分子拴在一起，還需要通過DNA連接酶在3’羥基和5’磷酸基團之間形成新的磷酸二酯鍵。大多數(shù)DNA連接酶都是從T4噬菌體中分離出來的，它可以催化在兩條DNA鏈的末端形成磷酸二酯鍵，包括粘性末端堿基配對的

29、兩條DNA鏈和末端都是平末端的兩條DNA鏈,其它常用工具酶,3. Tag DNA聚合酶：是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具有5’→ 3’聚合酶活性，該酶最適反應溫度為75~80 ℃，主要用途是進行PCR反應。,4. 逆轉錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）主要作用是將mRNA反轉錄成cDNA,（二）堿性磷酸酶,其作用是去除DNA、RNA的5’磷酸根（ 5’-P），以防自身環(huán)化；另外在用32P標記5’末端前，可先用其去除DN

30、A或RNA上的5’- P,（三）核酸酶,S1核酸酶：主要用于去除DNA片段粘末端而產生平端；打開cDNA中發(fā)夾結構，使其成平端。核糖核酸酶（RNaseA)：在質粒提取時降解RNA；從DNA-RNA雜交體中去除未雜交的RNA區(qū)。,第五節(jié) 外源基因導入宿主細胞,二、克隆載體對宿主的要求,一、宿主的基本要求與性質　　1、能夠高效吸收外源DNA；　　2、根據載體的類型和標記選擇合適宿主，例： M13 噬菌體載體，選擇含有F因子雄性大腸桿

31、菌； λ噬菌體載體，選擇E.coliK12?！　?、不具有限制修飾系統(tǒng)，故不會使導入宿主細胞內未經修飾的外源DNA發(fā)生降解；　　4、一般為重組缺陷型（RecA-）菌株，使克隆載體DNA與宿主染色體DNA之間不發(fā)生同源重組； 5、安全：需嚴格限制載體的宿主范圍，以達到盡量避免重組體從實驗室逃逸出去。,1、外源DNA導入導入原核細胞（1）轉化和轉染：外源DNA以重組質粒載體形式存在，則可通過轉化導入原核細胞；外源 DN

32、A構建成重組噬菌體DNA或重組噬菌質粒，則可通過轉染方式進入 宿主細胞。感受態(tài)細胞：用氯化鈣處理宿主細胞，使細胞變得易于吸引外源DNA。（2）λDNA的侵染（體外包裝轉染技術）體外包裝（將重組DNA分子與λ噬菌體的頭部、尾部以及有關包裝蛋白混合，組裝成具感染力的λ噬菌體粒子）感染宿主。較轉染效率要高出104－105倍。,三、外源基因導入宿主細胞,,2、外源DNA導入真核細胞　（1）外源DNA導入酵母細胞（轉化）,酵母細胞,原

33、生質體,蝸牛酶,CaCl2和聚乙二醇,復合體（含DNA的原生質體）,,,長出有壁細胞,再生培養(yǎng)基中,,（2）外源DNA導入哺乳動物細胞　　　 其中最簡便的是微量注射法和電穿孔法。（3）外DNA導入植物細胞　　　 除了微量注射法及電穿孔法可將外源DNA導入植物細胞外。 還有兩種方法，一種是基因槍法或稱微彈槍法；另一種是將含有重組Ti質粒的根癌土壤桿菌與植物原生質體共培養(yǎng)（即共培養(yǎng)法）或與植物葉片培養(yǎng)（即葉片培養(yǎng)法）。,

34、1. 載體選擇標記的鑒定,(1) 抗生素平板法 (2) 插入失活法 (3) β-半乳糖苷酶顯色反應法,四、目的克隆的篩選與鑒定,抗生素平板法,,缺點:假陽性高,插入失活法,因外源 DNA 的插入而導致基因失活的現(xiàn)象，稱為插入失活（ insertional inactivation ）,β - 半乳糖苷酶顯色反應法,蘭-白斑篩選：某些載體，如M13，PUC系列，PGEM質粒系列等，都帶有l(wèi)ac Z’基因的一段序列，編碼β–半乳糖苷酶

35、的α肽；而宿主細胞為Lac Z △M15的突變株時， α肽可與△M15進行α互補，產生具有活性的β–半乳糖苷酶。若將轉化細胞涂布在含有異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和呈色物質5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X–gal)培養(yǎng)基的平板上時，可形成藍色菌落。,當外源DNA插入到這一區(qū)段，則會破壞α互補作用。這時若將轉化細胞涂布在含有IPTG和X–gal培養(yǎng)基的平板上，則形成無色菌落。,2. 目的基因序列的鑒定,菌落（或

36、噬菌斑）原位雜交（ in situ hybridization ） 內切酶圖譜鑒定 PCR 鑒定,菌落（或噬菌斑）原位雜交,將轉化細胞培養(yǎng)在瓊脂平板上，當形成菌落或噬菌斑后，再將硝酸纖維濾膜貼在平板上，使菌落或噬菌斑轉印到硝酸纖維濾膜上。翻轉此濾膜并置于另一不含菌的平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)后的濾膜上可長出菌落或噬菌斑。取出濾膜，用裂解液處理使菌體裂解，釋放出 DNA 。再用堿處理，使 DNA 變性，經烘烤將變性 DNA 固定于濾膜上。然

37、后用放射性同位素標記的核酸探針進行分子雜交，并經放射自顯影，黑點代表雜交上的菌落，即可篩選到陽性克隆。,內切酶圖譜鑒定,將初步篩選的陽性克隆小量培養(yǎng)后，提取重組質粒或重組噬菌體 DNA ，用 1~2 種內切酶酶切，然后進行凝膠電泳，檢測插入 DNA 片段大小。,雙酶切鑒定重組質粒,,,DNA 序列測定,最后為了確證目的基因序列的正確性，必須對重組體的 DNA 進行序列測定,,表達產物氨基酸序列測定,一般分析N-末端（15個殘基序列）和C

38、-末端（一般5個）氨基酸鑒別蛋白質的性質和同質性；,第六節(jié) 外源基因在細菌中的表達,基因工程的主要目的是使外源基因能在細菌、酵母或動、植物細胞中得到高效表達，以便獲得大量有益的基因表達產物或改變微生物或動、植物的遺傳性狀。 所謂表達載體（ expression vector ）是指宿主細胞基因表達所需調節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細胞內轉錄和翻譯的載體。,1. 啟動子 （ promoter ）,啟動子是指 RNA 聚合酶結合于 D

39、NA 并起始合成 RNA 的一段 DNA 控制序列。原核基因啟動子位于轉錄起點（ transcription initiation ）上游（左側），它由兩段彼此分開且又高度保守的核心序列組成。,一 外源基因轉錄,原核表達系統(tǒng)中常用啟動子,① lac 啟動子，是乳糖操縱子的啟動子，受 lac I 編碼的阻遏蛋白調節(jié)控制；② trp 啟動子，是色氨酸操縱子啟動子，受 trpR 編碼的阻遏蛋白調控；③ tac 啟動子，由 lac 啟動子

40、的 -10 區(qū)和 trp 啟動子 -35 區(qū)融合而成，匯合了 lac 和 trp 兩者優(yōu)點，是一個很強的啟動子，同樣受 LacI 阻遏蛋白調控 。④ P(L 、 R) 啟動子，是λ噬菌體左、右向啟動子，其溫度敏感的阻遏蛋白受溫度調控；⑤ T 7 噬菌體啟動子，比大腸桿菌啟動子強得多且十分專一，只被 T 7 RNA 聚合酶所識別。,2. 轉錄的調節(jié)和控制,通常表達載體不應使外源基因始終處于轉錄和翻譯之中。這是由于某些有價值的外源蛋白可

41、能對宿主細胞是有毒的，外源蛋白的過量表達必將影響細胞生長；,宿主細胞的生長和外源基因的表達應該分成兩個階段進行。第一階段使含有外源基因的宿主細胞迅速生長直至獲得足夠量的細胞。第二階段是啟動開關，使所有細胞外源基因同時高效表達，產生大量有價值的表達產物。外源基因表達常采用化學物質誘導與溫度誘導兩種不同方法。,化學物質誘導,當用lac啟動子構建表達載體時，lac啟動子受CAP蛋白和cAMP的正調控。受阻遏蛋白的負調控；當宿主細胞生長

42、時，lac I基因產生的阻遏蛋白與lac操縱基因結合，阻礙外源基因的轉錄和表達，此時細胞大量生長和繁殖。加入誘導物IPTG后，由于誘導物與阻遏蛋白結合，使其不能與操縱基因結合。于是，外源基因被誘導而高效轉錄和表達。,溫度誘導,當用λPL、R啟動子構建表達載體時，PL、R啟動子受λ噬菌體cI基因的負調控，cI基因產生的阻遏蛋白結合在操縱基因上，阻止轉錄的進行。目前利用cI的溫度敏感突變基因（cI 857 ts）調節(jié)這種阻遏。當在28-

43、30℃培養(yǎng)時，該突變體產生有活性阻遏蛋白，阻遏PL、R轉錄，細菌大量生長。在獲得足夠量菌體后，使溫度上升至42℃，造成阻遏蛋白失活，PL、R解除阻遏，啟動外源基因的高效轉錄和表達，從而合成大量有價值的外源蛋白。,轉錄終止子,轉錄終止子指一段位于基因或操縱子的３ ' 末端，具有終止轉錄功能的特定 DNA 序列。高效表達載體應該含有終止子，因為合成的 mRNA 過長，不僅消耗細胞內的底物和能量，且易使 mRNA 形成妨礙翻譯的二級

44、結構。,三 外源基因表達產物,為了在原核細胞中表達非融合蛋白，可將帶有起始密碼子 ATG 的真核基因插入到合適的原核啟動子和 SD 序列下游。經轉錄和翻譯，就可在原核細胞中，表達出非融合蛋白。,1. 非融合蛋白的表達,2. 融合蛋白的表達,所謂融合蛋白是指蛋白質的 N 端由宿主基因（通常只是 N 端的部分序列）編碼， C 端由外源基因編碼的蛋白質，換言之，融合蛋白是由一條短的原核多肽和真核蛋白結合在一起的雜合蛋白。,3. 外源蛋白的

45、分泌表達,分泌型表達載體除具有一般表達載體的基本結構外，還需要具有編碼信號肽的序列。通常信號肽與外源蛋白的 N 端連接，由于信號肽含有帶正電荷的氨基酸和疏水氨酸，故能攜帶表達蛋白越膜分泌到周質或胞外，然后質膜上的信號肽酶將信號肽切除。,4. 包涵體 （ inclusion body ）,當外源蛋白在大腸桿菌高水平表達時，常常在細胞質內聚集而形成包涵體。利用大腸桿菌生產的非融合蛋白多數(shù)情況下以包涵體形式存在。 形成包涵體有利于外源蛋白

46、的高水平表達和防止蛋白酶對其的降解，也可避免外源蛋白對宿主細胞的毒害。此外也有利于表達產物的分離。但包涵體形式的表達蛋白不具生物學活性，需要體外復性。,第七節(jié) 基因工程的應用,基因工程藥物轉基因植物轉基因動物基因治療在微生物研究中應用,基因工程藥品 —— 胰島素,胰島素是治療糖尿病的特效藥。一般臨床上使用的胰島素主要從豬、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取4～5g胰島素。用該方法生產的胰島素產量低，價格昂貴，遠不能

47、滿足社會需要。1979年，科學家將動物體內的胰島素基因與大腸桿菌DNA分子重組，并在大腸桿菌內實現(xiàn)了表達。1982年，美國一家基因公司用基因工程方法生產的胰島素投入市場，售價降低了30%～50%。,干擾素是病毒侵入細胞后產生的一種糖蛋白。干擾素幾乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一種抗病毒的特效藥。此外干擾素對治療某些癌癥和白血病也有一定療效。傳統(tǒng)的干擾素生產方法是從人血液中的白細胞內提取，每300 L血液只能提取出1 mg干擾素。19

48、80～1982年，科學家用基因工程方法在大腸桿菌及酵母菌細胞內獲得了干擾素，是傳統(tǒng)的生產量的12萬倍。1987年上述干擾素大量投放市場。,基因工程藥品 —— 干擾素,基因工程藥品 —— 生長激素,治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長激素。而生長激素的獲得很困難。以前，要獲得生長激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長激素。 現(xiàn)可利用基因工程方法，將人的生長激素基因導入大腸桿菌中，使其生產生長激素。人們從 450 L

49、大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當于6萬具尸體的全部產量。,基因工程藥物的生產過程,1、目的基因的提取：分離或合成外源基因。2、體外重組：外源基因與載體體外連接，構建重組DNA分子；3、轉化：重組DNA分子導入細胞。4、篩選與鑒定；5、基因表達：控制適當條件，外源DNA表達。6、表達產物的純化,轉基因動物,轉基因動物指把人或哺乳動物的某種基因導入到哺乳動物(如鼠、兔、羊和豬)的受精卵里，目的基因若與受精卵染色體DNA整合，細

50、胞分裂時，該基因隨染色體的倍增而倍增，使每個細胞中都帶有目的基因，使性狀得以表達，并穩(wěn)定地遺傳給后代，從而獲得基因產品。這樣一種新的個體，稱為~。,轉基因植物,1983年世界首例轉基因植物培育成功，標志著人類用轉基因技術改良農作物的開始。1986年轉基因農作物獲得批準進入田間試驗;1994年美國Calgene公司培育的延熟保鮮的轉基因番茄被批準商品化生產，2000年全世界轉基因農作物的種植面積達4,420萬公頃，發(fā)展速度非常迅猛。,

51、小結,1. 基因工程，即DNA重組技術，是在分子生物學、微生物學基礎上結合有關現(xiàn)代科學和工程學原理和方法而開拓的新興技術領域。它的出現(xiàn)促使生物技術迅猛發(fā)展，改變了生物科學面貌，并帶動了生物技術產業(yè)的興起。2. 基因工程的操作主要包括：基因的分離、合成和重組，基因的分子克隆，基因的測序和鑒定，基因的體外擴增和定位誘變，基因的表達等技術。3. 基因克隆載體通常由病毒、噬菌體和細菌質粒DNA改建而成，并需選擇適當微生物作為克隆基因的宿主。

52、微生物為基因操作提供了各種工具酶。,4. 微生物是常用的克隆和表達載體的宿主，可通過多種方法將載體導入宿主細胞；通過構建和篩選基因文庫和cDNA文庫可以獲得目的基因，目的基因與載體連接后可以通過多種方法篩選獲得重組體；5. 原核表達載體的主要元件包括啟動子、核糖體的結合位點、轉錄終止信號、密碼子偏愛性等；6. 聚合酶鏈式反應（ PCR ），是一種在體外快速擴增特定 DNA 序列的技術。通過基因定向誘變可構建不同的基因突變體；,謝