微生物與基因工程

1、第 十 章 微生物與基因工程,基因工程技術(shù),基因工程（genetic engineering)：把分離到的或合成的基因經(jīng)過(guò)改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而得到大量基因產(chǎn)物，或令生物表現(xiàn)出新的形狀。,基因工程大事記,1973 Cohen和Boyer第一次將重組體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了DNA的分子克隆;1978 Genentech公司---人胰島素---世界上第一種基因工程蛋白藥物 1982 第一個(gè)基

2、因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用 1985 第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國(guó) 轉(zhuǎn)基因魚,1993 基因工程西紅柿在美國(guó)上市2019 英國(guó)羅斯林研究所-克隆羊多莉2019.9 中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃, 負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的1%2000.6.26 科學(xué)家公布人類基因組工作草圖2019.2.11 公布人類基因組基本信息,第一節(jié) 基因工程概述,三項(xiàng)重要技術(shù)為基因工程奠定

3、了基礎(chǔ):1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶為基因工程提供了有力的工具；1972年Berg等將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功；1973年Cohen和Boyer第一次將重組體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了DNA的分子克隆; 1977年Boyer等首先將人工合成的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽；1975-1977年Sanger、

4、Maxam和Gilbert先后發(fā)明了三種DNA序列的快速測(cè)定法；90年代全自動(dòng)核酸序列測(cè)定儀的問世；,一、基因工程基本過(guò)程,1、目的基因的提?。悍蛛x或合成外源基因。2、體外重組：外源基因與載體體外連接，構(gòu)建重組DNA分子；3、轉(zhuǎn)化：重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞。4、擴(kuò)增該克隆DNA。5、篩選與鑒定；6、基因表達(dá)：控制適當(dāng)條件，外源DNA表達(dá)。7. 獲得表達(dá)產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物。,一切基因工程操作都離不開微生物1、基因工程

5、所用克隆載體主要是用病毒、噬菌體和質(zhì)粒改造而成的。2、基因工程所用千余種工具酶是從微生物中得到的。3、微生物細(xì)胞是基因克隆的宿主。4、大規(guī)模表達(dá)基因產(chǎn)物，構(gòu)建工程菌，利用工廠發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)。5、提供基因資源（抗高溫、高鹽、高堿、低溫等特性）。6、模式生物提供基礎(chǔ)理論。,二、微生物與基因工程關(guān)系,第二節(jié) 基因的分離合成和誘變,利用重組DNA技術(shù)，可將某一原核生物或真核生物染色體基因組的全部遺傳信息，貯存在由重組體群體（如重組噬菌體群

6、體）構(gòu)成的基因文庫(kù)(genomic library)或cDNA文庫(kù)(cDNA library),1. 基因文庫(kù)的構(gòu)建,所謂基因文庫(kù)是指生物染色體基因組各DNA片段的克隆總體。文庫(kù)中的每一個(gè)克隆只含基因組中某一特定的DNA片段。一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)包括該生物染色體基因組全部遺傳信息（即全部DNA序列）。,2、基因文庫(kù)的構(gòu)建步驟：（1）從組織或細(xì)胞提取基因組DNA；（2）用限制性酶部分水解或機(jī)械剪切成適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA　　　　　 片段

7、，經(jīng)分級(jí)分離選出一定大小合適克隆的DNA片 　　　　　 段；（3）選擇容載量較大的克隆載體，通常采用λ噬菌體或　　　　　 柯斯質(zhì)粒載體，在適當(dāng)位點(diǎn)將載體切開；（4）將基因組DNA片段與載體進(jìn)行體外連接；（5）重組體DNA直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌或用體外包裝的重組λ噬　　　　　 菌體顆粒感染敏感細(xì)菌細(xì)胞。最后得到攜帶重組 　　　　 DNA的細(xì)菌群體或噬菌體群體即構(gòu)成基因文庫(kù)。,2. c

8、DNA文庫(kù)構(gòu)建,所謂cDNA文庫(kù)是指生物體全部mRNA的cDNA克隆總體。cDNA文庫(kù)中的每一個(gè)克隆只含一種mRNA信息。由于真核生物基因組十分龐大，因此要求構(gòu)建基因文庫(kù)的庫(kù)容量要足夠大，才能篩選到某一目的基因。但基于這樣一個(gè)事實(shí)，即細(xì)胞中的mRNA分子數(shù)要比基因組的基因數(shù)小得多（通常大約僅有15%左右基因被表達(dá)），因而若由mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，那么所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的庫(kù)容量相應(yīng)比基因文庫(kù)小。,構(gòu)建cDNA文庫(kù)的主要步驟：①?gòu)?/p>

9、生物體或細(xì)胞中提取mRNA。②利用逆轉(zhuǎn)錄酶以寡聚(dT)或隨機(jī)寡聚核苷酸為引物合成cDNA的第一條鏈。③利用DNA聚合酶I，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當(dāng)引物合成cDNA第二條鏈;常用RNA酶H在雜交分子的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物;或是除去雜交分子的mRNA后，加入隨機(jī)引物，即可合成第二條鏈。④cDNA與載體的體外連接。⑤噬菌體的體外包裝及感染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。由于cDNA不含基因的啟動(dòng)子和內(nèi)含子，因而序

10、列比基因短，其克隆載體可選用質(zhì)?；虿《据d體。,基因的化學(xué)合成,DNA 的合成 自 DNA 合成儀問世后，化學(xué)合成已可完全自動(dòng)化，在半個(gè)小時(shí)內(nèi)可合成 30~35 個(gè)堿基的寡核苷酸。目前化學(xué)合成寡核苷酸片段的長(zhǎng)度約為 150~200 個(gè)核苷酸左右。,PCR 擴(kuò)增技術(shù)的原理和應(yīng)用,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ polymerase chain reaction, PCR ），是一種在體外快速擴(kuò)增特定 DNA 序列的新技術(shù)。bbioo/video/2

11、019/351.htm,如果 DNA 片段兩端的序列是已知的，則先要合成一對(duì)寡聚核苷酸引物，它們各自與所需擴(kuò)增的靶 DNA 片段的末端互補(bǔ)。 PCR 由 3 個(gè)基本反應(yīng)組成。 ① 變性: 加熱，模板 DNA 經(jīng)熱變性，成為兩條單鏈； ② 退火: 使溫度下降，寡核苷酸引物即與模板 DNA 中所要擴(kuò)增序列兩端的堿基配對(duì)； ③ 延伸: 在適宜條件下引物 3‘ 端向前延伸，合成與模板堿基序列完全互補(bǔ)的 DNA 鏈。DNA 片段以 2 的指數(shù)

12、增長(zhǎng)，重復(fù) 25~30 次循環(huán)，擴(kuò)增的 DNA 片段拷貝數(shù)可增至 10 6 -10 7 倍。,PCR 擴(kuò)增技術(shù)原理,PCR 技術(shù)的實(shí)際用途,① 可用于 DNA 的擴(kuò)增和克隆，制備單鏈或雙鏈 DNA 探針；也可用于定位誘變和 DNA 測(cè)序。 ② 在臨床醫(yī)學(xué)上可用于檢測(cè)病原體，診斷遺傳病，以及對(duì)癌基因的分析確定。 ③用于法醫(yī),以鑒別個(gè)體和判定親緣關(guān)系。,基因誘變,寡核苷酸介導(dǎo)的突變 盒式誘變 　PCR介導(dǎo)的突變,第三節(jié)　微生物

13、與克隆載體,載體：克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體克隆載體：外源DNA片段進(jìn)行克隆，需要一個(gè)合適的載體，將其運(yùn)送到細(xì)胞中并進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增。這種以擴(kuò)增外源DNA為目的載體，稱為克隆載體。,克隆載體應(yīng)具備的性質(zhì),1、可獨(dú)立自主復(fù)制，具備復(fù)制原點(diǎn)；2、具有若干限制酶單一切割位點(diǎn)，且位于載體復(fù)制的非必需區(qū)，以便插入外源基因后不影響復(fù)制。3、有可供選擇的遺傳標(biāo)記（抗性基因、顯色反應(yīng)），以便于對(duì)陽(yáng)性克隆的鑒別和篩選。4、具有一定安全性，在胞內(nèi)不

14、發(fā)生重組與轉(zhuǎn)移，在胞外不發(fā)生不能自由擴(kuò)散。,目前克隆載體種類,質(zhì)粒載體λ噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體M13噬菌體載體真核細(xì)胞的克隆載體人工染色體。,一、質(zhì)粒載體,1、特點(diǎn)：（1）具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn)；（2）具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量。1－200kb，外源DNA≤15kb；（3）具有較高拷貝數(shù)，多為松馳控制型。人為增加拷貝數(shù)可用終濃度10－20μg/ml，氯霉素停止細(xì)胞蛋白合成，宿主DNA合成終止，質(zhì)粒復(fù)制正常進(jìn)行，可達(dá)數(shù)千個(gè)拷貝；（

15、4）具有便于選擇的標(biāo)記；（5）易于導(dǎo)入細(xì)胞，質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)化和電穿孔等方法導(dǎo)入細(xì)胞；（6）具有限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)。,pBR322的結(jié)構(gòu)特征,環(huán)狀雙鏈DNA分子，由4361bp組成，松馳型;colEⅠ復(fù)制起點(diǎn)，外源DNA大小為5kb左右;四環(huán)素抗性基因（Tetr）、氨芐青霉素抗性基因（Ampr）;24單一酶切位點(diǎn)（ Tetr中7個(gè)， Ampr中3個(gè)）。,二、λ噬菌體克隆載體,λ噬菌體克隆載體的構(gòu)建,野生型λDNA包裝的上限為50.

16、5kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，插入片段至多為2.0kb，如果將其縮短便能夠提高裝載量。插入型載體在插入位點(diǎn)有一酶切口，但這必須是唯一的；取代型載體在取代位點(diǎn)有兩個(gè)酶切口，多了也不行，而天然的λDNA上有許多重復(fù)的酶切口，如：EcoRI 5個(gè)，HindIII 7個(gè)，這些多余的酶切口必須被刪除,I 插入型載體,經(jīng)改造后的長(zhǎng)度為37kb，為包裝的下限，插入片段最大為13.5kb（50.5-37kb）由于該類載體重組與否均可包裝，因而為區(qū)

17、分組子與非重組子必須攜帶標(biāo)記基因。,II 取代型載體,經(jīng)改造后的長(zhǎng)度約為40kb，含兩個(gè)酶切口，兩者間的距離為14kb，然后用外源DNA片段取代之。包裝下限為37kb，這類載體不需要標(biāo)記基因，因?yàn)榭蛰d的載體DNA只有26kb，不可能被包裝，因而無(wú)法進(jìn)入受體細(xì)胞中去。,λ噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn),可在體外包裝成噬菌體，高效感染大腸桿菌裝載外源DNA的量大（≤23kb）重組λ-DNA的篩選提取方便λ噬菌體載體常用于構(gòu)建基因文庫(kù)。,三、 M1

18、3噬菌體載體,1、 M13 噬菌體基本特點(diǎn)：（1） M13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂；（2） M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA ，由 6407 的堿基組成 ；（3）在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删w DNA （正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈 DNA ，用于 DNA 的復(fù)制，因此這種雙鏈 DNA 稱為復(fù)制型 DNA （re

19、plicative form DNA） ，即 RF DNA ；,利用真核生物作為克隆載體宿主具有兩個(gè)重要意義。第一，它促進(jìn)了對(duì)真核生物復(fù)雜基因組及其基因調(diào)控的研究；第二，它有利于真核基因產(chǎn)物的翻譯后加工。釀酒酵母是一種理想的真核生物克隆載體宿主。,四、真核生物的克隆載體,1.酵母質(zhì)粒載體酵母質(zhì)粒載體都是利用其2μm質(zhì)粒和其酵母染色體組分與細(xì)菌質(zhì)粒pBR322構(gòu)建而成的?？煞謩e在細(xì)菌、酵母中復(fù)制，又稱穿梭質(zhì)粒。主要有三種：

20、附加體質(zhì)粒、復(fù)制質(zhì)粒、整合質(zhì)粒,,（1）附加體質(zhì)粒（episomal plasmid）,① 結(jié)構(gòu)：pBR322的復(fù)制起點(diǎn)、Ampr（氨芐青霉素抗性基因）；2μm的復(fù)制起點(diǎn)；酵母選擇標(biāo)記的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3）。② 細(xì)胞中拷貝數(shù)：酵母中高拷貝數(shù)。,（2）復(fù)制質(zhì)粒,含有：來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）。來(lái)自酵母染色體的自主復(fù)制序列（ARS）；作為酵母選擇標(biāo)

21、記的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1）。這種質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，能在大腸桿菌或酵母細(xì)胞中復(fù)制，重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞中可獲得中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒。,（3）整合質(zhì)粒,含有：來(lái)自pBR322的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因（Ampr）、四環(huán)素抗性基因（Tetr）。來(lái)自酵母的URA3基因；它既可以作為酵母細(xì)胞的選擇標(biāo)記，也可與酵母染色體DNA進(jìn)行同源重組。這種質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中復(fù)制，但不能在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制。一旦導(dǎo)入酵母細(xì)胞，可整

22、合到酵母染色體上，成為染色體DNA的一個(gè)片段。,2.真核生物病毒載體,（1）哺乳動(dòng)物病毒載體：目前利用許多哺乳動(dòng)物病毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等改造后的衍生物作為基因載體。（2）昆蟲病毒載體：主要為高克隆容量（100kb）；其次具有高表達(dá)效率（25％）；安全，僅感染無(wú)脊椎動(dòng)物；（3）植物病毒載體,五、人工染色體,酵母人工染色體（YAC）：能容納最大外源DNA片段。1、組成：著絲粒（centromere，CEN）、端

23、粒（telomere， TEL）、酵母自主復(fù)制序列（ARS）、選擇性標(biāo)記（如URA3）。2、功能：大片段克?。?00萬(wàn)bp），多用于真核生物基因庫(kù)的載體。3、相關(guān)：細(xì)菌人工染色體（BAC）。,常用工具酶種類 內(nèi)切酶 把DNA長(zhǎng)鏈切割為短的片段 連接酶 將2段DNA片段拼接起來(lái) 聚合

24、酶 催化合成形成核酸鏈 末端轉(zhuǎn)移酶 片段末端加接多聚核苷酸 核酸酶 水解酶，非專一性 反向轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶,第四節(jié)　微生物與基因工程工具酶,一、限制性內(nèi)切酶,1、限制性內(nèi)切酶的定義 是指已被證明是限制修飾系統(tǒng)中的一個(gè)組成部分，具有識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核酸序列并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的酶統(tǒng)稱

25、為限制性內(nèi)切酶。,限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),Luria和Human發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將外來(lái)的DNA片段在某些專一位點(diǎn)上切斷，從而保證其不被外來(lái)噬菌體所感染，而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾（甲基化）而得以保護(hù)，這種現(xiàn)象叫做限制－修飾。Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到一種酶，能夠特異性的切割DNA，這個(gè)酶被命名為Hind I,這是第一個(gè)分離到的限制性內(nèi)切核酸酶。,3、限制性核酸內(nèi)切酶的命名,按酶來(lái)源菌的屬、種名而定，取屬名的第一

26、個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作略語(yǔ)表示；如有株名，再加上一個(gè)字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。,4、限制性內(nèi)切酶的類型,限制性內(nèi)切酶可分為三大類型：類型I和類型III ：由于識(shí)別位點(diǎn)并非嚴(yán)格專一，很少被應(yīng)用。類型II的特點(diǎn): 識(shí)別位點(diǎn)嚴(yán)格專一；識(shí)別序列的堿基數(shù)一般為4

27、、6、8個(gè)bp；識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)常是一種回文序列的DNA；是DNA重組技術(shù)最為常用的工具酶。,寡核苷酸順序具有二沖旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸，又稱為回文順序（palindromic sequence） GAA TTC CTT AAG也有一些對(duì)稱順序被一個(gè)或幾個(gè)非特定的核苷酸間隔開。N-四種均可 Py-嘧啶 Pu-嘌呤如GTPyPuAC Hind I,6、限制性內(nèi)切酶的切割方式,

28、就切割位點(diǎn)相對(duì)于對(duì)稱軸的位置而言,切割方式有三種:在對(duì)稱軸5' 側(cè)切割產(chǎn)生5' 粘端在對(duì)稱軸3' 側(cè)切割產(chǎn)生3' 粘端在對(duì)稱軸處切割產(chǎn)生平端,二、DNA連接酶,配對(duì)的堿基產(chǎn)生的氫鍵還不足以把兩個(gè)DNA分子拴在一起，還需要通過(guò)DNA連接酶在3’羥基和5’磷酸基團(tuán)之間形成新的磷酸二酯鍵。大多數(shù)DNA連接酶都是從T4噬菌體中分離出來(lái)的，它可以催化在兩條DNA鏈的末端形成磷酸二酯鍵，包括粘性末端堿基配對(duì)的

29、兩條DNA鏈和末端都是平末端的兩條DNA鏈,其它常用工具酶,3. Tag DNA聚合酶：是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具有5’→ 3’聚合酶活性，該酶最適反應(yīng)溫度為75~80 ℃，主要用途是進(jìn)行PCR反應(yīng)。,4. 逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）主要作用是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,（二）堿性磷酸酶,其作用是去除DNA、RNA的5’磷酸根（ 5’-P），以防自身環(huán)化；另外在用32P標(biāo)記5’末端前，可先用其去除DN

30、A或RNA上的5’- P,（三）核酸酶,S1核酸酶：主要用于去除DNA片段粘末端而產(chǎn)生平端；打開cDNA中發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使其成平端。核糖核酸酶（RNaseA)：在質(zhì)粒提取時(shí)降解RNA；從DNA-RNA雜交體中去除未雜交的RNA區(qū)。,第五節(jié) 外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞,二、克隆載體對(duì)宿主的要求,一、宿主的基本要求與性質(zhì)　　1、能夠高效吸收外源DNA；　　2、根據(jù)載體的類型和標(biāo)記選擇合適宿主，例： M13 噬菌體載體，選擇含有F因子雄性大腸桿

31、菌； λ噬菌體載體，選擇E.coliK12?！　?、不具有限制修飾系統(tǒng)，故不會(huì)使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源DNA發(fā)生降解；　　4、一般為重組缺陷型（RecA-）菌株，使克隆載體DNA與宿主染色體DNA之間不發(fā)生同源重組； 5、安全：需嚴(yán)格限制載體的宿主范圍，以達(dá)到盡量避免重組體從實(shí)驗(yàn)室逃逸出去。,1、外源DNA導(dǎo)入導(dǎo)入原核細(xì)胞（1）轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染：外源DNA以重組質(zhì)粒載體形式存在，則可通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入原核細(xì)胞；外源 DN

32、A構(gòu)建成重組噬菌體DNA或重組噬菌質(zhì)粒，則可通過(guò)轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入 宿主細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞：用氯化鈣處理宿主細(xì)胞，使細(xì)胞變得易于吸引外源DNA。（2）λDNA的侵染（體外包裝轉(zhuǎn)染技術(shù)）體外包裝（將重組DNA分子與λ噬菌體的頭部、尾部以及有關(guān)包裝蛋白混合，組裝成具感染力的λ噬菌體粒子）感染宿主。較轉(zhuǎn)染效率要高出104－105倍。,三、外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞,,2、外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞?。?）外源DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞（轉(zhuǎn)化）,酵母細(xì)胞,原

33、生質(zhì)體,蝸牛酶,CaCl2和聚乙二醇,復(fù)合體（含DNA的原生質(zhì)體）,,,長(zhǎng)出有壁細(xì)胞,再生培養(yǎng)基中,,（2）外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞　　　 其中最簡(jiǎn)便的是微量注射法和電穿孔法。（3）外DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞　　　 除了微量注射法及電穿孔法可將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞外。 還有兩種方法，一種是基因槍法或稱微彈槍法；另一種是將含有重組Ti質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)（即共培養(yǎng)法）或與植物葉片培養(yǎng)（即葉片培養(yǎng)法）。,

34、1. 載體選擇標(biāo)記的鑒定,(1) 抗生素平板法 (2) 插入失活法 (3) β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法,四、目的克隆的篩選與鑒定,抗生素平板法,,缺點(diǎn):假陽(yáng)性高,插入失活法,因外源 DNA 的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱為插入失活（ insertional inactivation ）,β - 半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法,蘭-白斑篩選：某些載體，如M13，PUC系列，PGEM質(zhì)粒系列等，都帶有l(wèi)ac Z’基因的一段序列，編碼β–半乳糖苷酶

35、的α肽；而宿主細(xì)胞為L(zhǎng)ac Z △M15的突變株時(shí)， α肽可與△M15進(jìn)行α互補(bǔ)，產(chǎn)生具有活性的β–半乳糖苷酶。若將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和呈色物質(zhì)5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X–gal)培養(yǎng)基的平板上時(shí)，可形成藍(lán)色菌落。,當(dāng)外源DNA插入到這一區(qū)段，則會(huì)破壞α互補(bǔ)作用。這時(shí)若將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有IPTG和X–gal培養(yǎng)基的平板上，則形成無(wú)色菌落。,2. 目的基因序列的鑒定,菌落（或

36、噬菌斑）原位雜交（ in situ hybridization ） 內(nèi)切酶圖譜鑒定 PCR 鑒定,菌落（或噬菌斑）原位雜交,將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)在瓊脂平板上，當(dāng)形成菌落或噬菌斑后，再將硝酸纖維濾膜貼在平板上，使菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上。翻轉(zhuǎn)此濾膜并置于另一不含菌的平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)后的濾膜上可長(zhǎng)出菌落或噬菌斑。取出濾膜，用裂解液處理使菌體裂解，釋放出 DNA 。再用堿處理，使 DNA 變性，經(jīng)烘烤將變性 DNA 固定于濾膜上。然

37、后用放射性同位素標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交，并經(jīng)放射自顯影，黑點(diǎn)代表雜交上的菌落，即可篩選到陽(yáng)性克隆。,內(nèi)切酶圖譜鑒定,將初步篩選的陽(yáng)性克隆小量培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體 DNA ，用 1~2 種內(nèi)切酶酶切，然后進(jìn)行凝膠電泳，檢測(cè)插入 DNA 片段大小。,雙酶切鑒定重組質(zhì)粒,,,DNA 序列測(cè)定,最后為了確證目的基因序列的正確性，必須對(duì)重組體的 DNA 進(jìn)行序列測(cè)定,,表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列測(cè)定,一般分析N-末端（15個(gè)殘基序列）和C

38、-末端（一般5個(gè)）氨基酸鑒別蛋白質(zhì)的性質(zhì)和同質(zhì)性；,第六節(jié) 外源基因在細(xì)菌中的表達(dá),基因工程的主要目的是使外源基因能在細(xì)菌、酵母或動(dòng)、植物細(xì)胞中得到高效表達(dá)，以便獲得大量有益的基因表達(dá)產(chǎn)物或改變微生物或動(dòng)、植物的遺傳性狀。 所謂表達(dá)載體（ expression vector ）是指宿主細(xì)胞基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。,1. 啟動(dòng)子 （ promoter ）,啟動(dòng)子是指 RNA 聚合酶結(jié)合于 D

39、NA 并起始合成 RNA 的一段 DNA 控制序列。原核基因啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)（ transcription initiation ）上游（左側(cè)），它由兩段彼此分開且又高度保守的核心序列組成。,一 外源基因轉(zhuǎn)錄,原核表達(dá)系統(tǒng)中常用啟動(dòng)子,① lac 啟動(dòng)子，是乳糖操縱子的啟動(dòng)子，受 lac I 編碼的阻遏蛋白調(diào)節(jié)控制；② trp 啟動(dòng)子，是色氨酸操縱子啟動(dòng)子，受 trpR 編碼的阻遏蛋白調(diào)控；③ tac 啟動(dòng)子，由 lac 啟動(dòng)子

40、的 -10 區(qū)和 trp 啟動(dòng)子 -35 區(qū)融合而成，匯合了 lac 和 trp 兩者優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子，同樣受 LacI 阻遏蛋白調(diào)控 。④ P(L 、 R) 啟動(dòng)子，是λ噬菌體左、右向啟動(dòng)子，其溫度敏感的阻遏蛋白受溫度調(diào)控；⑤ T 7 噬菌體啟動(dòng)子，比大腸桿菌啟動(dòng)子強(qiáng)得多且十分專一，只被 T 7 RNA 聚合酶所識(shí)別。,2. 轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)和控制,通常表達(dá)載體不應(yīng)使外源基因始終處于轉(zhuǎn)錄和翻譯之中。這是由于某些有價(jià)值的外源蛋白可

41、能對(duì)宿主細(xì)胞是有毒的，外源蛋白的過(guò)量表達(dá)必將影響細(xì)胞生長(zhǎng)；,宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)應(yīng)該分成兩個(gè)階段進(jìn)行。第一階段使含有外源基因的宿主細(xì)胞迅速生長(zhǎng)直至獲得足夠量的細(xì)胞。第二階段是啟動(dòng)開關(guān)，使所有細(xì)胞外源基因同時(shí)高效表達(dá)，產(chǎn)生大量有價(jià)值的表達(dá)產(chǎn)物。外源基因表達(dá)常采用化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)與溫度誘導(dǎo)兩種不同方法。,化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo),當(dāng)用lac啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，lac啟動(dòng)子受CAP蛋白和cAMP的正調(diào)控。受阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控；當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)

42、時(shí)，lac I基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合，阻礙外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞大量生長(zhǎng)和繁殖。加入誘導(dǎo)物IPTG后，由于誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使其不能與操縱基因結(jié)合。于是，外源基因被誘導(dǎo)而高效轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。,溫度誘導(dǎo),當(dāng)用λPL、R啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，PL、R啟動(dòng)子受λ噬菌體cI基因的負(fù)調(diào)控，cI基因產(chǎn)生的阻遏蛋白結(jié)合在操縱基因上，阻止轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。目前利用cI的溫度敏感突變基因（cI 857 ts）調(diào)節(jié)這種阻遏。當(dāng)在28-

43、30℃培養(yǎng)時(shí)，該突變體產(chǎn)生有活性阻遏蛋白，阻遏PL、R轉(zhuǎn)錄，細(xì)菌大量生長(zhǎng)。在獲得足夠量菌體后，使溫度上升至42℃，造成阻遏蛋白失活，PL、R解除阻遏，啟動(dòng)外源基因的高效轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而合成大量有價(jià)值的外源蛋白。,轉(zhuǎn)錄終止子,轉(zhuǎn)錄終止子指一段位于基因或操縱子的３ ' 末端，具有終止轉(zhuǎn)錄功能的特定 DNA 序列。高效表達(dá)載體應(yīng)該含有終止子，因?yàn)楹铣傻?mRNA 過(guò)長(zhǎng)，不僅消耗細(xì)胞內(nèi)的底物和能量，且易使 mRNA 形成妨礙翻譯的二級(jí)

44、結(jié)構(gòu)。,三 外源基因表達(dá)產(chǎn)物,為了在原核細(xì)胞中表達(dá)非融合蛋白，可將帶有起始密碼子 ATG 的真核基因插入到合適的原核啟動(dòng)子和 SD 序列下游。經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯，就可在原核細(xì)胞中，表達(dá)出非融合蛋白。,1. 非融合蛋白的表達(dá),2. 融合蛋白的表達(dá),所謂融合蛋白是指蛋白質(zhì)的 N 端由宿主基因（通常只是 N 端的部分序列）編碼， C 端由外源基因編碼的蛋白質(zhì)，換言之，融合蛋白是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的雜合蛋白。,3. 外源蛋白的

45、分泌表達(dá),分泌型表達(dá)載體除具有一般表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)外，還需要具有編碼信號(hào)肽的序列。通常信號(hào)肽與外源蛋白的 N 端連接，由于信號(hào)肽含有帶正電荷的氨基酸和疏水氨酸，故能攜帶表達(dá)蛋白越膜分泌到周質(zhì)或胞外，然后質(zhì)膜上的信號(hào)肽酶將信號(hào)肽切除。,4. 包涵體 （ inclusion body ）,當(dāng)外源蛋白在大腸桿菌高水平表達(dá)時(shí)，常常在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集而形成包涵體。利用大腸桿菌生產(chǎn)的非融合蛋白多數(shù)情況下以包涵體形式存在。 形成包涵體有利于外源蛋白

46、的高水平表達(dá)和防止蛋白酶對(duì)其的降解，也可避免外源蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的毒害。此外也有利于表達(dá)產(chǎn)物的分離。但包涵體形式的表達(dá)蛋白不具生物學(xué)活性，需要體外復(fù)性。,第七節(jié) 基因工程的應(yīng)用,基因工程藥物轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因治療在微生物研究中應(yīng)用,基因工程藥品 —— 胰島素,胰島素是治療糖尿病的特效藥。一般臨床上使用的胰島素主要從豬、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取4～5g胰島素。用該方法生產(chǎn)的胰島素產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)不能

47、滿足社會(huì)需要。1979年，科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)的胰島素基因與大腸桿菌DNA分子重組，并在大腸桿菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。1982年，美國(guó)一家基因公司用基因工程方法生產(chǎn)的胰島素投入市場(chǎng)，售價(jià)降低了30%～50%。,干擾素是病毒侵入細(xì)胞后產(chǎn)生的一種糖蛋白。干擾素幾乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一種抗病毒的特效藥。此外干擾素對(duì)治療某些癌癥和白血病也有一定療效。傳統(tǒng)的干擾素生產(chǎn)方法是從人血液中的白細(xì)胞內(nèi)提取，每300 L血液只能提取出1 mg干擾素。19

48、80～1982年，科學(xué)家用基因工程方法在大腸桿菌及酵母菌細(xì)胞內(nèi)獲得了干擾素，是傳統(tǒng)的生產(chǎn)量的12萬(wàn)倍。1987年上述干擾素大量投放市場(chǎng)。,基因工程藥品 —— 干擾素,基因工程藥品 —— 生長(zhǎng)激素,治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長(zhǎng)激素。而生長(zhǎng)激素的獲得很困難。以前，要獲得生長(zhǎng)激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長(zhǎng)激素。 現(xiàn)可利用基因工程方法，將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)氪竽c桿菌中，使其生產(chǎn)生長(zhǎng)激素。人們從 450 L

49、大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長(zhǎng)激素，相當(dāng)于6萬(wàn)具尸體的全部產(chǎn)量。,基因工程藥物的生產(chǎn)過(guò)程,1、目的基因的提?。悍蛛x或合成外源基因。2、體外重組：外源基因與載體體外連接，構(gòu)建重組DNA分子；3、轉(zhuǎn)化：重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞。4、篩選與鑒定；5、基因表達(dá)：控制適當(dāng)條件，外源DNA表達(dá)。6、表達(dá)產(chǎn)物的純化,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物指把人或哺乳動(dòng)物的某種基因?qū)氲讲溉閯?dòng)物(如鼠、兔、羊和豬)的受精卵里，目的基因若與受精卵染色體DNA整合，細(xì)

50、胞分裂時(shí)，該基因隨染色體的倍增而倍增，使每個(gè)細(xì)胞中都帶有目的基因，使性狀得以表達(dá)，并穩(wěn)定地遺傳給后代，從而獲得基因產(chǎn)品。這樣一種新的個(gè)體，稱為~。,轉(zhuǎn)基因植物,1983年世界首例轉(zhuǎn)基因植物培育成功，標(biāo)志著人類用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良農(nóng)作物的開始。1986年轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物獲得批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn);1994年美國(guó)Calgene公司培育的延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄被批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，2000年全世界轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的種植面積達(dá)4,420萬(wàn)公頃，發(fā)展速度非常迅猛。,

51、小結(jié),1. 基因工程，即DNA重組技術(shù)，是在分子生物學(xué)、微生物學(xué)基礎(chǔ)上結(jié)合有關(guān)現(xiàn)代科學(xué)和工程學(xué)原理和方法而開拓的新興技術(shù)領(lǐng)域。它的出現(xiàn)促使生物技術(shù)迅猛發(fā)展，改變了生物科學(xué)面貌，并帶動(dòng)了生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的興起。2. 基因工程的操作主要包括：基因的分離、合成和重組，基因的分子克隆，基因的測(cè)序和鑒定，基因的體外擴(kuò)增和定位誘變，基因的表達(dá)等技術(shù)。3. 基因克隆載體通常由病毒、噬菌體和細(xì)菌質(zhì)粒DNA改建而成，并需選擇適當(dāng)微生物作為克隆基因的宿主。

52、微生物為基因操作提供了各種工具酶。,4. 微生物是常用的克隆和表達(dá)載體的宿主，可通過(guò)多種方法將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；通過(guò)構(gòu)建和篩選基因文庫(kù)和cDNA文庫(kù)可以獲得目的基因，目的基因與載體連接后可以通過(guò)多種方法篩選獲得重組體；5. 原核表達(dá)載體的主要元件包括啟動(dòng)子、核糖體的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、密碼子偏愛性等；6. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR ），是一種在體外快速擴(kuò)增特定 DNA 序列的技術(shù)。通過(guò)基因定向誘變可構(gòu)建不同的基因突變體；,謝