實(shí)驗(yàn)四++細(xì)菌的接種培養(yǎng)法與生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察

1、實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的接種培養(yǎng)法與生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察【目的和要求】【目的和要求】1掌握無(wú)菌技術(shù)，建立無(wú)菌觀念；明確無(wú)菌操作時(shí)注意要點(diǎn)。2掌握細(xì)菌的接種、分離培養(yǎng)方法和接種環(huán)的制作方法。3熟悉細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象的觀察方法。【試劑與器材】【試劑與器材】1菌種：葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等。2培養(yǎng)基：固體、半固體、液體培養(yǎng)基。3其他：溫箱、酒精燈、接種環(huán)、接種針、L形玻棒、打火機(jī)、記號(hào)筆等?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、細(xì)菌的接種工具1接種環(huán)和接種

2、針：其結(jié)構(gòu)包括環(huán)（針）、金屬柄、絕緣柄三部分（見(jiàn)圖41）。其中環(huán)（針）部分最佳材料為白金絲，因其受熱和散熱速度快，硬度適宜，不易生銹且經(jīng)久耐用，但因?yàn)閮r(jià)格昂貴而限制了其應(yīng)用。目前實(shí)驗(yàn)室常用的是經(jīng)濟(jì)實(shí)用的300~500W電熱鎳鉻絲。一般要求接種環(huán)長(zhǎng)5~8cm，直徑為2~4mm，定量接種環(huán)的容量為0.001ml。圖41接種環(huán)和接種針接種環(huán)（針）在使用之前需檢查鎳鉻絲是否呈直線，若有彎曲，需用吸管或接種環(huán)的另一端將其壓直；若環(huán)不圓，可將鎳鉻絲

3、前端放在吸管尖部纏繞一圈，再將鎳鉻絲突出的部分朝內(nèi)壓緊。接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的接種，接種針用于半固體培養(yǎng)基的接種。2L形玻棒：由直徑2~3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。在使用之前用厚紙包扎后置高壓蒸汽滅菌，或沾取無(wú)水乙醇后在火焰上燒灼滅菌。主要用于液體標(biāo)本涂布接種。二、細(xì)菌的接種方法1液體培養(yǎng)基的接種液體培養(yǎng)基的接種該法主要用于細(xì)菌的增菌培養(yǎng)或進(jìn)行細(xì)菌的生化反應(yīng)。方法：（圖42）（1）先將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許細(xì)菌

4、。（2）左手拿試管，右手持接種環(huán)，用右手其余手指將試管塞打開(kāi)，試管口通過(guò)火焰燒灼滅菌。（3）將接種環(huán)在貼近液面的管壁上上下碾磨數(shù)次，使細(xì)菌均勻分布于培養(yǎng)基中。（4）將試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。（5）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。4）在平板底上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。圖45固體培養(yǎng)基分區(qū)劃線法4斜面培養(yǎng)基接斜面培養(yǎng)基接種法（圖46）斜面培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的純培養(yǎng)，以進(jìn)一步鑒定

5、細(xì)菌或保存菌種。（1）將接種環(huán)（或接種針）在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后以無(wú)菌操作挑取少許菌落。（2）左手拿試管，打開(kāi)試管塞后，試管口通過(guò)火焰滅菌，再將取有細(xì)菌的接種環(huán)由斜面底部向上劃一直線，再由下至上在斜面上作曲線劃線。（3）試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。圖46斜面培養(yǎng)基接種法5涂布接種法本法主要用于活菌計(jì)數(shù)和藥敏試驗(yàn)。（1）活菌計(jì)數(shù)：取一定稀釋度的菌液0.1ml滴

6、在平板上，用無(wú)菌L型玻璃棒將液滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后計(jì)數(shù)菌落，則每毫升所含活菌數(shù)=菌落數(shù)10稀釋倍數(shù)。（2）直接涂布法：多用于紙片法和管碟法藥敏試驗(yàn)。先配制一定濃度的菌液，用無(wú)菌棉簽蘸取菌液后，在管壁上將多余的液體擠去，在MH瓊脂平板上按三個(gè)方向均勻涂布3次，最后沿平板邊緣涂一周。蓋上平板蓋，置室溫放置5min使平板表面稍干，然后用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，或向豎在平板表面的牛津小杯內(nèi)加入不同濃度的藥

7、物，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果，測(cè)定抑菌圈直徑，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。6傾注培養(yǎng)法此法常用于標(biāo)本或樣品中活菌計(jì)數(shù)。（1）方法：1）將標(biāo)本用無(wú)菌生理鹽水稀釋成不同濃度：101、102、103、104、105等。2）取不同稀釋度的標(biāo)本各1ml分別注入直徑90mm無(wú)菌平皿，迅速加入溶化并冷卻至約50℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂15ml，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板使之充分混勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平板。3）置35℃溫箱孵育18~24h，計(jì)數(shù)菌落形成單位（colonyfming