Ihh敲除導(dǎo)致小鼠生長(zhǎng)板形成受阻的現(xiàn)象觀察.pdf

1、目的：
　　1、觀察 Ihh(印度刺猬蛋白)基因敲除后小鼠生長(zhǎng)板大體結(jié)構(gòu)及其內(nèi)軟骨細(xì)胞形態(tài)分布的改變；
　　2、觀察Ihh基因敲除后小鼠骨骺?jī)?nèi)（本應(yīng)形成生長(zhǎng)板的區(qū)域）礦化現(xiàn)象改變的具體過(guò)程及特點(diǎn)；
　　3、初步觀察Ihh基因敲除后小鼠生長(zhǎng)板內(nèi)Ihh下游相關(guān)因子PTHrP及BMP-6的表達(dá)變化趨勢(shì)。
　　方法：
　　用基因型為 Ihhfl/fl和 Col2a1-Cre ERT2;Ihhfl/fl的基因工程小鼠

2、繁殖，并用RT-PCR技術(shù)鑒定新生小鼠基因型。將鑒定出的剛出生的基因型為 Col2a1-Cre ERT2;Ihhfl/fl小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。于小鼠出生后第一天及第二天，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射雌激素受體拮抗劑 TM（托馬西酚）溶液誘導(dǎo)敲除 Ihh基因，對(duì)照組小鼠腹腔注射同等量植物油。完成Ihh基因敲除后：①取小鼠出生后第14天，觀察兩組小鼠大體照，并行下肢X線觀察小鼠下肢脛骨。②分別在小鼠出生后第6、8、10、12、14天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)

3、通過(guò)番紅O染色觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨骺?jī)?nèi)各種類型軟骨細(xì)胞形態(tài)和分布的特點(diǎn)及變化，③及通過(guò)Vonkasso（礦化）染色觀察骨骺礦化過(guò)程的變化。④用出生后第6天小鼠通過(guò)免疫組織化學(xué)染色初步觀察Ihh下游相關(guān)因子甲狀旁腺激素相關(guān)肽（PTHrP）及骨形態(tài)發(fā)生蛋白6（BMP-6）的表達(dá)變化趨勢(shì)。
　　結(jié)果：
　　第六天實(shí)驗(yàn)組小鼠番紅 O染色顯示脛骨近端骨骺無(wú)明顯的按軟骨細(xì)胞成熟程度形成的結(jié)構(gòu)分區(qū)，但有大量異常出現(xiàn)的大而圓的肥大軟骨細(xì)胞充

4、填在骨骺?jī)?nèi)，而幾乎觀察不到扁平的呈柱狀排列的增殖形態(tài)軟骨細(xì)胞；對(duì)照組小鼠則顯示骨骺結(jié)構(gòu)發(fā)育良好且按軟骨細(xì)胞分化程度依次形成：靜止軟骨細(xì)胞區(qū)、增殖軟骨細(xì)胞區(qū)及肥大軟骨細(xì)胞區(qū)。第八天實(shí)驗(yàn)組小鼠番紅 O染色可見骨骺?jī)?nèi)軟骨細(xì)胞進(jìn)一步成熟肥大，并通過(guò) Vonkasso染色可見骨骺?jī)?nèi)有數(shù)個(gè)礦化點(diǎn)出現(xiàn)；而對(duì)照組小鼠骨骺?jī)?nèi)則無(wú)礦化現(xiàn)象出現(xiàn)。第10天實(shí)驗(yàn)組小鼠Vonkasso染色可見骨骺?jī)?nèi)出現(xiàn)大量礦化點(diǎn)；而在對(duì)照組小鼠骨骺?jī)?nèi)仍未發(fā)現(xiàn)礦化，但開始形成二次骨

5、化中心。第12天實(shí)驗(yàn)組小鼠骨骺礦化現(xiàn)象延伸到骨骺大部分區(qū)域；而對(duì)照組小鼠骨骺二次骨化中心初步形成。第14天實(shí)驗(yàn)組小鼠礦化現(xiàn)象占據(jù)骨骺除未來(lái)形成關(guān)節(jié)軟骨的所有區(qū)域，且礦化密度增加，最終并無(wú)生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)形成；而對(duì)照組小鼠二次骨化中心及生長(zhǎng)板發(fā)育已完善。第6天實(shí)驗(yàn)組小鼠骨骺PTHrP（聚集于增殖區(qū)軟骨細(xì)胞周圍）免疫組化染色較對(duì)照組小鼠明顯變淺，而BMP-6（表達(dá)于肥大區(qū)軟骨細(xì)胞內(nèi)）則較對(duì)照組小鼠染色加深。第14天Ihh基因敲除組小鼠身長(zhǎng)及四肢短

6、縮畸形最為明顯，并于X線下觀察下肢時(shí)發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組小鼠脛骨近端骨骺可見經(jīng)典生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)（即骺線）及二次骨化中心結(jié)構(gòu)，Ihh基因敲除組小鼠生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)完全消失。
　　結(jié)論：
　　Ihh基因與小鼠生長(zhǎng)板內(nèi)軟骨細(xì)胞按分化程度有序分區(qū)的現(xiàn)象密切相關(guān)。將小鼠Ihh基因敲除后，本應(yīng)未來(lái)形成生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)區(qū)域的軟骨細(xì)胞過(guò)早肥大成熟、基質(zhì)礦化,導(dǎo)致正常生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)難以形成，并可能會(huì)引起抑制軟骨細(xì)胞成熟的 PTHrP及促進(jìn)軟骨細(xì)胞成熟的BMP-6表達(dá)變化