應(yīng)用骨膠原凝膠雙相接種法構(gòu)建組織工程骨及其循環(huán)灌注培養(yǎng)觀察.pdf

1、目的：探索一種高效提取骨膠原的方法，并制備骨膠原凝膠用于種子細胞雙相接種法構(gòu)建組織工程骨，觀察構(gòu)建的效果；試制循環(huán)灌注式三維組織培養(yǎng)裝置用于組織工程骨培養(yǎng)，以提高其傳質(zhì)效率；應(yīng)用循環(huán)灌注式三維組織培養(yǎng)裝置培養(yǎng)雙相接種法構(gòu)建的組織工程骨，觀察雙相接種技術(shù)與灌注培養(yǎng)在組織工程骨構(gòu)建中相結(jié)合的效果。 方法：1、設(shè)計增強酶解法從豬皮質(zhì)骨中提取骨膠原，通過大體觀察、計算提取率、氨基酸成分分析、分子量測定等指標對骨膠原進行鑒定，應(yīng)用倒置顯微

2、鏡和組織學方法觀察骨髓間充質(zhì)干細胞在骨膠原凝膠中的生長、分布情況；2、試制出循環(huán)灌注式三維組織培養(yǎng)裝置，然后對其流量、恒溫效果、無菌性能和氣體交換效果進行檢測，鑒定其作為組織培養(yǎng)平臺的能力；3、應(yīng)用自制骨膠原凝膠液和已建立的種子細胞雙相接種法構(gòu)建組織工程骨，分成二組：實驗組應(yīng)用循環(huán)灌注式三維組織培養(yǎng)裝置進行灌注培養(yǎng)，對照組置于CO2孵箱中進行平皿培養(yǎng)，計算種子細胞上架率，大體、倒置顯微鏡及掃描電鏡分別觀察兩組細胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)的不同；H

3、E染色比較觀察兩組在組織結(jié)構(gòu)和細胞在基質(zhì)中分布情況方面的區(qū)別；測定堿性磷酸酶(ALP)活性、DNA含量和鈣含量及骨鈣素免疫組織化學染色，比較兩種培養(yǎng)方法對MSCs增殖、分化的影響。 結(jié)果：1、增強酶降解法提取骨膠原可達到94.04％的提取率。骨膠原氨基酸組成中甘氨酸占35.6％，脯氨酸及羥脯氨酸占27.5％，最大光吸收波長為232nm。蛋白電泳結(jié)果顯示，膠原凝膠液以單體α1和α2成分為主，含有一定量的二聚體和低聚體，其成分最低分

4、子量為79000。電泳后產(chǎn)生清晰的5個條帶，分別代表二種單體、二種二聚體和低聚體；2、骨膠原凝膠液粘度高，可在pH近中性環(huán)境中約10min固化，MSCs在骨膠原凝膠中呈三維均相分布，約2小時開始伸展，膠原凝膠發(fā)生收縮；3、試制了一種循環(huán)灌注式三維組織培養(yǎng)裝置，在設(shè)定溫度下，箱體內(nèi)晝夜溫差可控制在1℃以內(nèi)。連續(xù)觀察、檢測在循環(huán)灌注式三維組織培養(yǎng)裝置中循環(huán)三周的培養(yǎng)液無細菌生長。培養(yǎng)液循環(huán)流量可控制在0-87.5ml/min,根據(jù)理論推算，

5、以DMEM/F12為培養(yǎng)介質(zhì)，以脫鈣骨基質(zhì)為支架材料，可產(chǎn)生0-47.2dyne/cm2的流體剪切應(yīng)力。組織工程骨在循環(huán)灌注式三維組織培養(yǎng)裝置中連續(xù)培養(yǎng)72小時，其pH值變化范圍為7.16-6.952，幅度明顯小于平皿培養(yǎng)法。O2分壓及CO2分壓變化均在正常范圍內(nèi)；4、雙相接種法構(gòu)建組織工程骨可獲得99.75％的細胞上架率，MSCs在接種后2小時開始伸展，膠原凝膠收縮出現(xiàn)裂隙，8小時細胞伸展良好；5、兩組ALP活性在3天后開始增加，7天

6、后實驗組顯著高于對照組(p＜0.05)，DNA含量在培養(yǎng)5天后兩組出現(xiàn)顯著性差異(p＜0.05)，10天后兩組DNA含量增加均趨緩；兩組鈣含量在培養(yǎng)10天后呈增加趨勢，14天后實驗組顯著高于對照組；6、HE染色顯示實驗組細胞密度高，在組織中分布均勻，而對照組細胞主要集中在基質(zhì)裂隙周壁，基質(zhì)中細胞較少；骨鈣素免疫組織化學染色提示實驗組細胞骨鈣素表達陽性率高。掃描電鏡見對照組組織塊表面孔隙大小不一致，形態(tài)不規(guī)則，而實驗組組織塊表面基質(zhì)孔隙呈

7、圓形，大小較一致。 結(jié)論：1、增強酶解法是一種高效提取骨膠原的方法，所提取的骨膠原純度高，固化特性好。2、骨膠原凝膠用于體外構(gòu)建組織工程骨可顯著提高種子細胞的上架率，并有利于種子細胞早期定植和早期恢復其生理功能；3、固化的骨膠原凝膠具有一定的機械強度，但不足以對抗細胞收縮，因此難以單獨用于構(gòu)建組織工程骨；4、循環(huán)灌注式三維組織培養(yǎng)裝置具有優(yōu)良的恒溫和無菌性能，在組織工程骨培養(yǎng)過程中能維持pH值、O2分壓和CO2分壓的相對恒定，是