用于檢測(cè)尿液中hiv抗體的膠體金免疫層析快速診斷試紙條的制備_李曉娜

1、[作者簡(jiǎn)介]李曉娜(1980)女碩士講師主要從事生物檢測(cè)技術(shù)和有機(jī)化學(xué)合成研究。＊通訊聯(lián)系人Email:yfguan@mail.cmu.edu.cn【微生物檢測(cè)方法】用于檢測(cè)尿液中HIV抗體的膠體金免疫層析快速診斷試紙條的制備李曉娜12趙曉陽(yáng)13郭亮1王彪1郝鳳進(jìn)1關(guān)一夫1＊(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室沈陽(yáng)1100012.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室沈陽(yáng)1100013.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室沈陽(yáng)11

2、0001)[摘要]目的:制備一種可以通過(guò)檢測(cè)尿液中HIV抗體來(lái)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)傷HIV感染的膠體金免疫層析快速診斷試紙條。方法:利用檸檬酸三鈉還原法制備直徑38nm的膠體金溶液利用HIV1gp41抗原標(biāo)記膠體金制備膠體金免疫復(fù)合物組裝膠體金免疫層析快速診斷試紙條。結(jié)果:膠體金顆粒粒徑均一膠體金免疫復(fù)合物性能穩(wěn)定特異性強(qiáng)試紙條檢測(cè)時(shí)間只需10～20min。結(jié)論:膠體金免疫層析試紙條使用簡(jiǎn)便檢測(cè)快速結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)需特殊的儀器設(shè)備性?xún)r(jià)比高適用于基層醫(yī)療單

3、位使用和對(duì)大量人群的規(guī)模篩查等。[關(guān)鍵詞]HIV檢測(cè)膠體金免疫層析尿液標(biāo)本快速檢測(cè)[中圖分類(lèi)號(hào)]R446.6[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]10048685(2009)04082304PreparationofcolloidalgoldimmunochromatographictestkitforquicklydiagnosingHIVantibodyinurineLIXiaona12ZHAOXiaoyang13GUOLiang1WANGB

4、iao1HAOFengjin1GUANYifu1＊(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiologyCollegeofBasicMedicalScienceChinaMedicalUniversityShenyang110001China2.DepartmentofChemistryCollegeofBasicMedicalScienceChinaMedicalUniversityShenyan

5、g110001China3.DepartmentofChemistryCollegeofBasicMedicalScienceShenyangMedicalUniversityShenyang110001China)[Abstract]Objective:TodevelopthecolloidalgoldimmunochromatographictestkitforquicknoninvasivediagnosisofHIVinfect

6、ionbytestingHIVantibodyinurine.Methods:Preparingthecolloidalgoldparticlesof38nmindiameterusingamethodofcitratetrisodiumimmobilizingHIV1gp41antigenoncolloidalgoldparticlesandassemblingthetestkit.Results:Colloidalgoldparti

7、clesareuniformthecolloidalgoldimmunocomplexisstablewithastrongspecificity.Testingresultscanbeobtainedin10～20minutes.Conclusion:Thecolloidalgoldimmunochromatographictestkitisconvenientinusewithfasttestingspeedandaccurater

8、esult.Thetestingresultcanbereadeasilywithoutanyassistanceofspecialapparatusandinstruments.Ithaspotentialutilityinfastmedicaldiagnosesandquickscreeningofmasspopulation.[Keywords]HIVdetectionColloidalgoldimmunochromatograp

9、hyUrinespecimenQuickdetectio艾滋病(AIDS)是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)引起的一種免疫缺陷性疾病近十幾年來(lái)在我國(guó)迅速蔓延。由于目前還沒(méi)有很好的預(yù)防性疫苗和治療方法早期診斷是預(yù)防艾滋病傳播的最佳方案。對(duì)艾滋病患者和可疑人群的普查和管理通常在指定的醫(yī)院和檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)進(jìn)行血液檢查。常用的HIV初篩方法有膠體金側(cè)流層析法(LFC)、核酸法(NAT)、明膠顆粒凝集法(PA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)。但是上述的檢測(cè)

10、方法都需要在國(guó)家認(rèn)定的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行(采集血樣、處理樣品和檢測(cè))而且在血液標(biāo)本采集過(guò)程中還存在著醫(yī)護(hù)人員和被檢測(cè)者會(huì)因針刺意外而感染艾滋病毒的危險(xiǎn)。因此這些現(xiàn)有的檢測(cè)檢驗(yàn)方法都不便于對(duì)艾滋病患者實(shí)施長(zhǎng)期的、追蹤式的、常規(guī)化檢測(cè)和對(duì)可疑人群實(shí)施規(guī)?；钠詹楹秃Y查。研究發(fā)現(xiàn)HIV病毒攜帶者的尿液中均含有抗艾滋病病毒的抗體這為我們提供了一個(gè)通過(guò)檢測(cè)尿液中的HIV抗體來(lái)判斷被檢人員的HIV病毒感染狀態(tài)的可能。20世紀(jì)80年代興起的膠體金免疫層

11、析檢測(cè)(goldimmunochromagraphyassayGICA)操作簡(jiǎn)單快捷、結(jié)果清晰易于判斷、無(wú)需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)技能和特殊設(shè)備。其原理是基于抗原抗體之間的特異性反應(yīng)。在硝酸纖維素膜上預(yù)先固定好特異性抗原(或抗體)和抗體做為2種捕獲劑分別作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)[1]。反應(yīng)物是固定于膠體金結(jié)合墊上并標(biāo)記了待測(cè)物抗原的膠體金顆粒。將樣品液滴加在試紙條的樣品墊上樣品液先溶解固定在膠體金結(jié)合墊上的膠體金并與樣品液中的待測(cè)物抗體形

12、成復(fù)合物。當(dāng)溶液在毛細(xì)管作用下到達(dá)T線時(shí)T線上的抗原與待測(cè)物抗體膠體金復(fù)合物再次發(fā)生特異性結(jié)合從而橋連膠體金被截留在T線上聚集并顯示出顏色[23]。因此可以根據(jù)試紙條T線的顏色深淺或有無(wú)來(lái)判斷樣品中是否含有待測(cè)物。該方法還是進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)的一種有效途徑[4～6]。本實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道了利用膠體金免疫層析法對(duì)尿液進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)的結(jié)果并由此制823中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2009年4月第19卷第4期ChineseJournalofHealthL

13、aboratoryTechnologyApr2009Vol19No4圖338nm膠體金顆粒、HIV1gp41抗原以及HIV1gp41抗原標(biāo)記的膠體金顆粒的紫外可見(jiàn)吸收光譜2.2HIV1gp41抗原標(biāo)記膠體金復(fù)合物的制備與純化按前述方法將膠體金溶液pH值調(diào)至7.5加入HIV1gp41抗原攪拌15min在磁力攪拌過(guò)程中加入BSA達(dá)終濃度后冷卻將標(biāo)記好的膠體金溶液超速離心棄沉淀后將上清再次離心小心地吸去上清其沉淀物即為初步純化的膠體金HIV抗

14、原復(fù)合物。將以此得到的超速離心純化后的膠體金HIV抗原復(fù)合物在透射電鏡下觀察。圖4是放大倍數(shù)為100萬(wàn)倍的透射電鏡下觀察到的未標(biāo)記的膠體金顆粒和HIV1gp41抗原標(biāo)記的膠體金顆粒的圖像。兩者對(duì)比可以觀察到HIV1gp41抗原標(biāo)記膠體金復(fù)合物外圍有明顯的低電子密度暈圈表明膠體金顆粒表面吸附有蛋白質(zhì)。利用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在200～800nm進(jìn)行掃描測(cè)定的吸收曲線中不僅有膠體金的特征吸收峰而且還有蛋白質(zhì)的特征吸收峰(圖3)與單純的蛋白質(zhì)

15、的特征吸收峰相比兩峰位置是一致的(λmax=280nm)。A:未標(biāo)記的膠體金顆粒(標(biāo)尺是50nm)B:HIV1gp41抗原標(biāo)記的膠體金顆粒(標(biāo)尺是100nm)圖4透射電鏡下的膠體金顆粒形態(tài)2.3臨床尿液標(biāo)本中HIV1抗體的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)《國(guó)家藥品監(jiān)督管理局令第3號(hào)》附件二:新生物制品申報(bào)資料項(xiàng)目(三)外診斷用品申報(bào)資料項(xiàng)目說(shuō)明。200份受檢尿樣中HIV1gp41膠體金法陽(yáng)性102份陰性98份ELISA法陽(yáng)性100份陰性100份。表2試

16、紙條性能參數(shù)檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)真陽(yáng)性真陰性合計(jì)檢測(cè)陽(yáng)性100(A)2(B)102(AB)檢測(cè)陰性0(C)98(D)98(CD)總數(shù)100(AC)100(BD)200(ABCD)2.3.1真實(shí)性指標(biāo)(1)靈敏度(真陽(yáng)性率)=A(AC)100%=100(1000)100%=100%(2)特異度(真陰性率)=D(BD)100%=98(298)100%=98%(3)假陽(yáng)性率=B(BD)100%=2(298)100%=2%(4)假陰性率=C(AC)

17、100%=0(1000)100%=0(5)粗一致率=(AD)(ABCD)100%=198200100%=99%(6)調(diào)整一致率=14〔A(AB)A(AC)D(CD)D(BD)〕100%=99%(7)約登指數(shù)=A(AC)D(BD)1=0.982.3.2預(yù)示值指標(biāo)(1)陽(yáng)性試驗(yàn)的預(yù)示值=A(AB)100%=100(1002)100%=98%(2)陰性試驗(yàn)的預(yù)示值=D(CD)100%=98(098)100%=100%經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)該試紙條特異性較

18、好與其它物質(zhì)無(wú)交叉反應(yīng)。三批試紙條檢測(cè)同一標(biāo)本及同一批次的試紙條檢測(cè)不同標(biāo)本3次檢測(cè)結(jié)果均穩(wěn)定。試紙條在4℃條件下保存90d室溫下保存75d37℃下保存15d檢測(cè)結(jié)果未發(fā)生改變。組裝好的試紙條置于相對(duì)濕度為40%～80%溫度18℃～25℃的含有干燥劑的鋁箔袋中保存?zhèn)溆?。試紙條雖然可在室溫下保存但大批暫時(shí)不用的試紙條應(yīng)該放在4℃保存以免抗體失效。從冰箱剛?cè)〕龅脑嚰垪l應(yīng)待其恢復(fù)至室溫然后再打開(kāi)密封避免試紙條凝集空氣中的水分造成T線模糊不清。

19、3討論本研究利用檸檬酸鈉還原法制備了膠體金顆粒利用HIV1gp41抗原對(duì)膠體金顆粒進(jìn)行了標(biāo)記。然后我們制備了快速診斷HIV感染的膠體金免疫層析試紙條并以此對(duì)尿液樣本中的抗HIV1gp41抗體進(jìn)行了檢測(cè)。臨床檢驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了該膠體金免疫層析試紙條可以通過(guò)檢測(cè)尿液中HIV抗體實(shí)現(xiàn)快速和安全地診斷被檢人員HIV的感染程度。和ELISA方法相比兩者的敏感性與特異性無(wú)差別。利用ELISA方法檢測(cè)時(shí)每一塊酶標(biāo)板一次可以檢測(cè)92人份樣品。但是ELI

20、SA檢測(cè)方法操作步驟繁雜必須由專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作完成僅適用于醫(yī)院和檢驗(yàn)檢疫部門(mén)等。而NAT檢測(cè)方法對(duì)技術(shù)要求高特別是血篩用對(duì)靈敏度要求更高標(biāo)本留樣和處理比較困難檢測(cè)之前病毒核酸容易降解造成假陰性檢測(cè)結(jié)果。聚集的膠體金顆粒呈現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的顏色檢測(cè)時(shí)不需要特殊的儀器和設(shè)備即可判讀結(jié)果。膠體金免疫層析試紙條法簡(jiǎn)易便捷無(wú)需復(fù)雜步驟個(gè)人能獨(dú)立完成檢測(cè)成本較低使得消費(fèi)者更易于接受。無(wú)需洗滌不形成免疫復(fù)合物的標(biāo)記抗原通過(guò)層析作用自動(dòng)分離既簡(jiǎn)化了操作步驟

21、又減少了影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾因素。該試紙條可以在5～10min內(nèi)完成檢測(cè)樣品處理方法簡(jiǎn)便、操作靈活、運(yùn)輸方便而且試紙條自帶質(zhì)量控制線實(shí)驗(yàn)結(jié)果一目了然為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了最方便適用的檢測(cè)手段特別適合于廣大醫(yī)療檢驗(yàn)檢疫人員和基層醫(yī)療人員使用以及大批量檢測(cè)和人群普查等具有簡(jiǎn)便、快速、特異、敏感、穩(wěn)定等特點(diǎn)因此該技術(shù)具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。在實(shí)際工作中一(下轉(zhuǎn)第888頁(yè))825中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2009年4月第19卷第4期ChineseJourn