番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒單克隆抗體的制備與膠體金免疫層析試紙條研制.pdf

1、番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(Tomatozonate spot virus,TZSV)屬于番茄斑萎病毒屬的一個(gè)新種，寄主范圍廣泛，可侵染34個(gè)科的166種的植物，植株感染后嚴(yán)重阻礙植物生長(zhǎng)，影響品質(zhì)和降低產(chǎn)量，尤其在云南，對(duì)當(dāng)?shù)胤?、辣椒的生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。目前的檢測(cè)方法多需要專門儀器和專業(yè)操作人員，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速大量檢測(cè)，因此建立簡(jiǎn)單、高效、快速的檢測(cè)方法對(duì)植物病害的診斷、病害流行規(guī)律的分析、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和病害防治等方面具有重要意義。本研究根據(jù)田

2、間快速檢測(cè)需求的現(xiàn)實(shí)情況，成功制備出了番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒的單克隆抗體，并以單抗和免疫層析技術(shù)為核心，建立了膠體金金免疫層析試紙條檢測(cè)方法，該方法具操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)。
　　通過原核表達(dá)番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒的核衣殼蛋白，純化透析去離子后，用作免疫小鼠的抗原，經(jīng)三次免疫后，檢測(cè)效價(jià)，對(duì)效價(jià)值最高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。采用雜交瘤技術(shù)，將沖擊免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞在PEG1500作用下融合，對(duì)初次篩選到的陽

3、性克隆進(jìn)行2～3次亞克隆篩選，獲得了三株可穩(wěn)定分泌抗TZSV-N蛋白的細(xì)胞株，命名為3A2、5D2、5F7，抗體亞型都為重鏈IgM，輕鏈K鏈。小鼠體內(nèi)誘生腹水后，對(duì)腹水抗體進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)、dot-ELISA和Western Blot分析，結(jié)果表明3A2、5D2、5F7的效價(jià)分別可達(dá)128000、64000、64000，在dot-ELISA分析中，三株都可特異性識(shí)別番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒，且不與包括同屬病毒番茄斑萎病毒等發(fā)生反應(yīng)。Western

4、Blot分析中，三株單抗都可與番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒產(chǎn)生特異性條帶。
　　本研究進(jìn)一步采用優(yōu)球蛋白沉淀法純化單克隆抗體并使用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金溶液用以標(biāo)記單克隆抗體。通過單克隆抗體配對(duì)實(shí)驗(yàn)，選擇3A2作為金標(biāo)抗體，5D2作為檢測(cè)線上包被抗體，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)最終選擇PH值7.5的膠體金溶液標(biāo)記150ug/ml的純化后抗體3A2。采用sigma公司羊抗鼠IgG稀釋10倍后，包被于硝酸纖維素膜(NC膜)的質(zhì)控線上，優(yōu)化金

5、標(biāo)抗體濃度、離子濃度等反應(yīng)條件，組裝成試紙條，用于試紙條的特異性與靈敏度分析。結(jié)果表明:制備的試紙條在5～10min之內(nèi)，即可特異性識(shí)別番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒，與黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus，SMV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)、鳳仙花壞