農(nóng)產(chǎn)品中四種常見真菌毒素免疫檢測技術(shù)研究.pdf

1、真菌毒素(Mycotoxin)是一類由真菌產(chǎn)生的小分子次級代謝產(chǎn)物，農(nóng)作物在生長、收獲、貯存和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)均易受到真菌毒素污染，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)400多種真菌毒素，大部分具有致癌、致畸和致突變作用且混合污染時(shí)毒性會顯著增強(qiáng)。真菌毒素可通過污染谷物和飼料或經(jīng)動物源性食品進(jìn)入食物鏈，對人類和動物健康造成嚴(yán)重傷害，近年來已成為食品安全領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。真菌毒素現(xiàn)有檢測方法包括生物鑒定法、化學(xué)分析法、儀器分析法和免疫分析法等。生物鑒定法專一性不強(qiáng);化學(xué)分析

2、法精確度低;儀器分析靈敏度高，可準(zhǔn)確定量，但樣本前處理復(fù)雜并且檢測儀器昂貴，難以在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用。免疫分析方法快速、靈敏度高、特異性好，并且成本較低，近年來在真菌毒素檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速。本課題選取農(nóng)產(chǎn)品中常見且危害較大的黃曲霉毒素B1(Alfatoxin B1，AFB1)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)、伏馬毒素B1(Fumonisin B1，F(xiàn)B1)和玉米赤霉烯酮(Zeralenone，ZEN)為檢測對象，以單克隆

3、抗體作為生物識別元件，基于競爭ELISA和免疫層析原理，結(jié)合信號放大、免疫傳感、抗體芯片等技術(shù)，建立多種真菌毒素的快速、敏感、高通量免疫檢測方法。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.赭曲霉毒素A的間接競爭ELISA定量檢測技術(shù)
　　對OTA單克隆抗體2D8的免疫學(xué)性質(zhì)進(jìn)行鑒定，以此抗體為基礎(chǔ)建立間接競爭酶聯(lián)免疫檢測法(ci-ELISA)?？贵w2D8效價(jià)為1:1.024×106，親和常數(shù)Ka=3.75×109 L/M，重

4、鏈為IgG1型，與赭曲霉毒素B(OchratoxinB，OTB)的交叉反應(yīng)率為5.4％，與AFB1、FB1、ZEN、桔青霉毒素(Citrinin，CIT)、展青霉毒素(Patulin，PAT)和嘔吐毒素(Deoxynivalenol，DON)均無交叉反應(yīng)。建立的ci-ELISA檢測限為0.08 ng/mL，檢測范圍0.12-1.18 ng/mL，加標(biāo)回收率可達(dá)91.2-110.3％，與商品化ELISA試劑盒相關(guān)性較好，可用于谷物及飼料樣

5、本中OTA的定量檢測與分析，也為后續(xù)其它免疫檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。
　　2.基于免疫磁珠和生物素-鏈霉親和素的間接競爭ELISA定量檢測玉米赤霉烯酮
　　為縮短反應(yīng)時(shí)間，提高檢測靈敏度，以納米磁珠作為固相載體包被ZEN單克隆抗體，基于競爭反應(yīng)原理，利用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，建立新型酶聯(lián)免疫檢測方法(MNP-bsELISA)。該方法檢測限為0.04 ng/mL，檢測范圍0.07-2.41ng/mL，加標(biāo)回收率為92.8-1

6、11.9％，變異系數(shù)小于10％，對天然樣本中ZEN的定量結(jié)果與LC-MS/MS方法具有良好的相關(guān)性。
　　3.赭曲霉毒素A磁珠-電化學(xué)免疫傳感檢測技術(shù)
　　優(yōu)化以磁珠為固相載體的免疫競爭反應(yīng)，選取最佳模式并結(jié)合電化學(xué)信號檢測技術(shù)，建立了OTA電化學(xué)免疫傳感檢測技術(shù)。該方法的檢測下限達(dá)到0.007ng/mL，檢測范圍為0.01-0.82 ng/mL，加標(biāo)回收率為78.7-91.6％，標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)均小于15％，穩(wěn)定性較好，

7、可實(shí)現(xiàn)樣本中OTA的痕量檢測。
　　4.赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮二聯(lián)免疫層析試紙條研制
　　基于免疫層析原理，分別建立了二聯(lián)定性和定量膠體金免疫層析檢測方法用于谷物和飼料中OTA和ZEN的檢測。其中二聯(lián)定性膠體金免疫層析試紙條對OTA和ZEN的檢測限分別為0.625 ng/mL和1.25 ng/mL，二聯(lián)定量膠體金免疫層析試紙條對OTA的檢測限為0.25 ng/mL，檢測區(qū)間為0.32-12.16 ng/mL;對ZEN的檢

8、測限為0.5 ng/mL，檢測區(qū)間為0.58-39.72 ng/mL;兩種真菌毒素在玉米、小麥和飼料樣品中加標(biāo)回收率為79.6-105.2％。制備的二聯(lián)免疫層析試紙條對樣本的檢測結(jié)果與LC-MS/MS相關(guān)性較好，可分別滿足樣本中OTA和ZEN的快速定性檢測與定量分析。
　　5.同時(shí)檢測四種真菌毒素的高通量抗體芯片定量技術(shù)
　　真菌毒素混合污染情況較為常見且毒性會顯著增強(qiáng)，為對樣本中四種常見真菌毒素（AFB1、OTA、FB1和

9、ZEN）進(jìn)行高通量、同時(shí)定量檢測，以硝酸纖維素膜為基板，利用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，建立抗體芯片檢測模式。該方法對AFB1、OTA、FB1、ZEN的檢測限分別為0.21、0.19、0.24和0.09 ng/mL，檢測區(qū)間分別為0.47-55.69、0.48-127.11、0.56-92.57和0.22-31.36 ng/mL。在實(shí)際樣本中的回收率為79.2-113.4％，變異系數(shù)小于10％，穩(wěn)定性較好，可對真菌毒素進(jìn)行多重定量檢測，在真

10、菌毒素混合污染監(jiān)測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　綜上所述，本研究將真菌毒素特異性單克隆抗體與磁性納米材料、生物素鏈霉親和素、電化學(xué)、芯片等信號放大和高通量檢測體系相結(jié)合，分別建立了ci-ELISA、MNP-bsELISA、磁珠電化學(xué)免疫傳感器、二聯(lián)定性和定量膠體金免疫層析試紙條和抗體芯片多重檢測技術(shù)，可滿足農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素快速便捷、高靈敏和高通量的檢測需求，為農(nóng)產(chǎn)品、食品和飼料中真菌毒素污染監(jiān)測體系的建立提供技術(shù)支撐，也為其他小分