（中醫(yī)資料）四逆湯中附子甘草配伍規(guī)律研究

1、收稿日期:2000202212四逆湯中附子甘草配伍規(guī)律研究陳建萍譚炳炎吳偉康張敏生李禮娟3韓超3(廣州中山醫(yī)科大學(xué)廣州510089)摘要:目的:觀察四逆湯中藥附子、甘草配伍前后主要成分的含量變化。方法:采用串聯(lián)質(zhì)譜ESI2MSΠMS及HPLC測(cè)定附子中的主要成分在配伍前后含量變化采用薄層掃描測(cè)定甘草中的主要成分甘草酸在配伍前后的含量變化。結(jié)果:附子與甘草配伍后烏頭類生物堿和甘草酸的含量均明顯降低。關(guān)鍵詞:附子甘草ESI2MSΠMSHPL

2、CTLC中圖分類號(hào):R28411文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):100529903(2001)0320016202四逆湯(SD)源于張仲景的《傷寒論》是治療少陰虛寒證的代表方劑臨床主要用于少陰病四肢逆冷下利清谷脈微細(xì)無(wú)力等癥。在既往的研究發(fā)現(xiàn)SD對(duì)冠心病心肌缺血具有良好的保護(hù)作用本研究在此基礎(chǔ)上以SD方藥為研究對(duì)象從方藥配伍的君、臣、佐、使關(guān)系出發(fā)以君藥附子為核心對(duì)其中藥味附子、甘草組成的方藥進(jìn)行藥物成分定性定量相關(guān)性分析對(duì)SD方藥中主要藥味配

3、伍進(jìn)行規(guī)律性的研究。1儀器和試劑API2365電噴霧離子化2質(zhì)譜質(zhì)譜(ESI2MSΠMS)聯(lián)用儀(Perkinelmer2SCIEX公司)Waters公司高效液相色譜儀486檢測(cè)器510泵810色譜工作站日本島津CS2930型雙波長(zhǎng)薄層掃描儀。中藥來(lái)源:附子(黑順片)(AconitiumcarmichaeliDebx.)、甘草(GlycyrrhizaeuralensisFisch)、干姜(Zin2giberofficinaleRosc.

4、)(均購(gòu)于廣州藥材公司經(jīng)廣州中藥大學(xué)藥鑒教研室鑒定)甘草浸膏用上述甘草原藥材自制甘草酸單銨鹽對(duì)照品(中國(guó)藥品生物檢定所)硅膠GF254(青島海洋化工廠)其他化學(xué)試劑均為分析純。2方法與結(jié)果211樣品溶液的制備分別稱取附子(50g)附子(50g)甘草(20g)附子(50g)甘草(20g)于4個(gè)燒杯中加入8倍量的水水浴煮沸2h過(guò)濾濾液濃縮醇沉取醇層回收乙醇將附子及甘草煎劑混合上述方法形成附子單煎劑附子與甘草的合煎劑以及附子甘草單煎后再混合此

5、三種溶液均以附子量定容至1:1得供試液備用。各取供試液5ml用氨水調(diào)pH值等于9溶液用乙醚提取2次每次10ml揮干渣用少量二氯甲烷溶解移入1ml容量瓶中加二氯甲烷至刻度搖勻備用。212對(duì)照品溶液的制備精密稱取烏頭堿210mg次烏頭堿213mg新烏頭堿115mg置小燒杯中加入二氯甲烷溶解后移入10ml容量瓶中加入二氯甲烷至刻度搖勻即得。213定性分析21311烏頭類生物堿的薄層分析將上述點(diǎn)樣液各取10μl點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上。用氯仿:

6、甲醇(9:1)為展開(kāi)系統(tǒng)加適量的氨水飽和展開(kāi)缸上行展開(kāi)展距13～15cm碘蒸氣為顯色劑進(jìn)行顯色。21312甘草的薄層層析各取供試液各10μl點(diǎn)于同一塊硅膠GF254薄層板上用正丁醇:冰醋酸:水(6:1:3)為展開(kāi)系統(tǒng)。紫外燈下顯色。214定量分析21411附子配伍前后烏頭類生物堿的含量變化掃描方式:Q1掃描(ESIΠMS)正離子Q3掃描分解CID譜。樣品處理:取Tab1中的方藥2ml用等量的甲醇稀釋過(guò)濾后用水稀釋10倍直接用spring

7、泵進(jìn)樣30μlΠmin計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理。用對(duì)照品掃描確定所測(cè)化學(xué)成分的離子峰得到分子量值及順序信息。MSΠMS分析:用串聯(lián)質(zhì)譜ESI2MSΠMS將對(duì)照品及各樣品溶液進(jìn)行測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。61第7卷第3期2001年6月中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFmulaeVol.7No.3Jun.2001?19952005TsinghuaTongfangOpticalDisc

8、Co.Ltd.Allrightsreserved.表1SD方藥不同配伍中烏頭類生物堿的MRM分析結(jié)果樣品結(jié)果烏頭堿次烏頭堿均值4381333530附子RSD16135%21215%濃度(μgΠml)3171619均值55127131133附甘RSD26107%71815%濃度(μgΠml)015016均值79121536混合物RSD16135%21215%濃度(μgΠml)01671521412甘草配伍前后甘草酸的含量變化測(cè)試樣品的制備

9、:4002g(相當(dāng)于甘草原生藥量215g)用50%乙醇適量充分溶解濾過(guò)棄去沉淀用50%乙醇定容50ml得甘草酸樣品液。取上述批號(hào)甘草浸膏等量按比例(附子:甘草=5:2)與附子醇沉液合并回收乙醇后用50%乙醇定容50ml得配伍樣品液Ⅰ和Ⅱ。樣品測(cè)定:分別準(zhǔn)確吸取各樣品液4μl和甘草酸標(biāo)準(zhǔn)液8μl分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上按213法展開(kāi)定位掃描測(cè)定記錄吸收度積分值。外標(biāo)一點(diǎn)法定量測(cè)得各樣品液甘草酸含量并將此成分與附子醇溶液合并后定容

10、與單純的甘草的體積相同。結(jié)果見(jiàn)表2。表2甘草酸樣品液及配伍樣品液Ⅰ和Ⅱ測(cè)定結(jié)果(mgn=3)項(xiàng)目平均值(?xs)CV(%)甘草酸樣品液9013851696129配伍樣品液Ⅰ7411321413125配伍樣品液Ⅱ76158117521293討論311從薄層色譜圖1可以看出附子附子甘草附子、甘草混合提取不同的配伍后附子的主要成分烏頭堿、次烏頭堿均存在但可能含量上有所變化。從薄層色譜圖2可以看出甘草、附子甘草以及單獨(dú)提取后再混合其甘草的主要成

11、分甘草酸及次甘劃酸的成份均存在。312從表1可知附子甘草合煎劑、附子、甘草單獨(dú)提取后再混合其中烏頭類生物堿的含量顯著降低。且附子中烏頭堿的穩(wěn)定性相對(duì)差些說(shuō)明兩味藥物相互作用可能產(chǎn)生不溶性的物質(zhì)(因?yàn)闉躅^堿與甘草中的甘草酸可能形成絡(luò)合物)從而減少烏頭堿、次烏頭堿的含量。從表2可知附子與甘草配伍后甘草酸的含量也有所降低。其原因與上述原因相同是附子與甘草的有關(guān)成分在一起形成不溶性的沉淀形成絡(luò)合物從而降低其含量用薄層色譜對(duì)兩藥配伍以后甘草酸的含

12、量也發(fā)生變化其減少的劑量與烏頭堿類生物堿一致。通過(guò)比較研究我們可以發(fā)現(xiàn)附子與甘草兩藥在配伍使用時(shí)較佳的方法為先單煎然后再混合為佳。從附子、甘草所含成分在同煎可能會(huì)發(fā)生絡(luò)合作用生成絡(luò)合物形成沉淀而被濾出。但其絡(luò)合物在進(jìn)入消化道以后可以在胃酸中或酶的作用下絡(luò)合物可以發(fā)揮生理作用效應(yīng)。還可能增加療效[1]同時(shí)降低附子中烏頭堿的毒副作用。筆者曾做過(guò)相關(guān)的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單味藥物的作用遠(yuǎn)不及藥味之間的配伍運(yùn)用。分析其機(jī)制可能是由于生物堿與甘草酸所

13、產(chǎn)生的沉淀在體內(nèi)的環(huán)境中會(huì)緩慢地釋放從而維持其血藥濃度。難怪在中藥經(jīng)典復(fù)方中沉淀將兩味藥同時(shí)使用充分體現(xiàn)了中藥復(fù)方配伍存在著的內(nèi)在規(guī)律。中藥復(fù)方配伍規(guī)律是十分復(fù)雜的過(guò)程其藥味之間作用與其成分相的關(guān)系不一定是正比例而在體外不起作用的成分進(jìn)入機(jī)體以后可能轉(zhuǎn)化成具有生物學(xué)活性的物質(zhì)而發(fā)揮藥理效應(yīng)[23]。參考文獻(xiàn):[1]陳建萍吳偉康譚紅梅.四逆湯方藥對(duì)缺血心肌冠脈流量的影響[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)199919(2):121.[2]陳建萍吳偉康

14、張敏生等.中藥復(fù)方配伍規(guī)律研究的思路與方法[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑雜志2000(1):1.[3]梁國(guó)剛.中藥復(fù)方化學(xué)研究方法的探討[J].中國(guó)中藥雜志199924(1):36.71第7卷第3期2001年6月中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFmulaeVol.7No.3Jun.2001?19952005TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.Lt