生物技術(shù)進(jìn)展

1、生物技術(shù)進(jìn)展氧化還原電位在微氧厭氧發(fā)酵中的控制和應(yīng)用摘要許多發(fā)酵產(chǎn)物是在微氧或厭氧條件下產(chǎn)生的，這樣的條件下溶解氧探頭檢測(cè)不到氧氣，這就為發(fā)酵過(guò)程的監(jiān)控和控制提出了一個(gè)挑戰(zhàn)。胞外氧化還原電位影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡和新陳代謝，易被檢測(cè)，這就為檢測(cè)和控制發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵過(guò)程提供了另一種替代選擇。本文回顧了氧化還原電位在影響基因表達(dá)，蛋白質(zhì)合成和代謝方面的最新進(jìn)展，以及如何通過(guò)控制P獲得更有效的發(fā)酵產(chǎn)物，比如在微氧條件下使酵母菌進(jìn)行乙醇型發(fā)酵

2、和在厭氧條件下使梭狀芽孢桿菌進(jìn)行以丁醇為主要產(chǎn)物的發(fā)酵。1綜述自人類的祖先開(kāi)始制作泡菜、酸奶、米酒等食品和飲料以來(lái)，發(fā)酵有著一個(gè)悠久的歷史。為了追求理想的風(fēng)味許多發(fā)酵是在微氧和厭氧條件下進(jìn)行的，同時(shí)要進(jìn)行污染控制因?yàn)榇蠖鄶?shù)有害微生物在有氧條件下迅速傳播。最近，在原油的可持續(xù)供給和石油基礎(chǔ)產(chǎn)品特別是運(yùn)輸燃料過(guò)度消費(fèi)給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)的影響受到關(guān)注，微氧和厭氧發(fā)酵條件下產(chǎn)生的生物燃料乙醇和丁醇也受到了全世界的關(guān)注。不同于有氧培養(yǎng)和溶解氧可以在線

3、監(jiān)測(cè)的發(fā)酵，微氧和厭氧發(fā)酵的一大挑戰(zhàn)是缺乏實(shí)時(shí)過(guò)程監(jiān)控技術(shù)，因?yàn)槌３０l(fā)酵過(guò)程中的PH值監(jiān)測(cè)僅僅反映了質(zhì)子活性，因此對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝的微妙變化它是不靈敏的。氧化還原電位，氧化還原或（P），反映整體的電子轉(zhuǎn)移和在細(xì)胞內(nèi)的代謝中涉及的氧化還原平衡，一個(gè)世紀(jì)前兩個(gè)劍橋大學(xué)的教授便預(yù)測(cè)到了它的意義。雖然在相對(duì)簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)中已經(jīng)確立了P原理和測(cè)量，但是P對(duì)生物系統(tǒng)中的核心細(xì)胞代謝的影響和生物工程中P控制的應(yīng)用仍是十分有限的。目前，為了深入理解細(xì)胞

4、內(nèi)的氧化還原平衡和細(xì)胞生理和代謝之間的影響，研發(fā)出可以穿透單個(gè)細(xì)胞的納米傳感器，能直接測(cè)量細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位，這為具有氧化還原途徑偏好的工程菌進(jìn)行理想發(fā)酵獲得期望的發(fā)酵產(chǎn)物提供了依據(jù)。另一方面，通過(guò)反映細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位同步電極便可以容易檢測(cè)到胞外的氧化還原電位，因此，如圖1所示，通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)P和代謝模式可以實(shí)現(xiàn)OPR控制策略。在這篇文章中，回顧了P對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝影響的最新進(jìn)展，以微氧條件下酵母釀酒中乙醇發(fā)酵和厭氧條件下梭狀芽孢桿菌產(chǎn)

5、丁醇作為例子，從分子水平和工藝過(guò)程兩個(gè)方面討論了獲得高效發(fā)酵產(chǎn)物的P控制策略。2P對(duì)代謝的影響2.1P原理P表示化合物獲得電子的趨勢(shì)。因此，一個(gè)氧化還原反應(yīng)中需要兩種化合物，反應(yīng)中還原性化合物將電子提供給氧化性化合物，每個(gè)氧化還原對(duì)有其內(nèi)在OPR值。電子親和力越強(qiáng)，氧化還原對(duì)的氧化還原電位就越高。表一概括了細(xì)胞內(nèi)新陳代謝中主要氧化還原對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)P值。不同于原電池半反應(yīng)，無(wú)論是好氧抗生素發(fā)酵、微氧或厭氧條件下乙醇丁醇發(fā)酵，氧化還原反應(yīng)都是在

6、細(xì)胞內(nèi)同時(shí)發(fā)生的。使得細(xì)胞外OPR監(jiān)測(cè)可以作為細(xì)胞內(nèi)電子傳遞和氧化還原平衡代謝凈結(jié)果的一個(gè)指標(biāo)。相對(duì)于提供質(zhì)子信息的PH值，P則表示了電子的活動(dòng)。因此P對(duì)細(xì)胞內(nèi)的微妙變化更為靈敏。P電極系統(tǒng)包括由鉑、銠、銥和金等惰性金屬構(gòu)成的檢測(cè)電極和由Ag和AgCl組成的參比電極組成，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵系統(tǒng)的氧化還原信息，這種電極對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝的影響可以忽略不計(jì)。2.2環(huán)境因素對(duì)P的影響一般情況下，溫度和氧化性還原性化合物的比例對(duì)調(diào)節(jié)溶液中氧化還原電位是

7、很關(guān)鍵的。氧化還原試劑鐵氰化鉀，甲基紫精和中性紅等化學(xué)物質(zhì)不同程度減少，可以作為影響環(huán)境P和細(xì)胞代謝的電子載體補(bǔ)充到發(fā)酵系統(tǒng)中(Bagramyanetal.2000Girbaletal.1995PeguinSoucaille1996)。另一方面，胱氨酸半胱氨酸，氧化還原的谷胱甘肽和NADHNAD是主要的生物氧化還原對(duì)，它們不僅影響P的狀態(tài)，而且可以直接作為細(xì)胞內(nèi)代謝的中間體。因此，可以補(bǔ)充維生素?zé)熕徇@樣的氧化還原試劑或者前體。3.2.3

8、充入氣體向發(fā)酵系統(tǒng)中充入氧、氫和一氧化碳這些氧化還原活性氣體控制P，溶解氧可以提高P，氫可以降低P。另外，也可以向發(fā)酵系統(tǒng)中充入惰性氣體氮?dú)夂秃夥蛛x溶解氧和氫，從而間接影響P。在釀酒酵母發(fā)酵過(guò)程中分別充入氧、氫、氦，創(chuàng)造不同的P條件，研究其對(duì)酵母菌生理和代謝的影響。通過(guò)P控制可以深入理解如何高效產(chǎn)乙醇。像嚴(yán)格厭氧的梭狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇這樣的厭氧發(fā)酵，一氧化碳抑制氫化，所以氫氣產(chǎn)物的充入可直接減少溶劑中物質(zhì)功耗。相比之下，通入氮?dú)饪梢?/p>

9、分離氫和激活產(chǎn)氫酶，從而提高發(fā)酵產(chǎn)氫量。4微氧條件下P控制：乙醇發(fā)酵乙醇燃料目前是全球范圍內(nèi)商業(yè)化生產(chǎn)的一種主要生物燃料，它的主原料是糖和淀粉。比較溫度，PH值，培養(yǎng)基成分這些參數(shù)，因?yàn)榕c糖酵解途徑相關(guān)的氧化還原平衡和乙醛產(chǎn)乙醇量的減少，在培養(yǎng)基含糖不超過(guò)250gL和發(fā)酵液中乙醇濃度低于13%的發(fā)酵條件下，P對(duì)乙醇發(fā)酵影響很小，如圖二所示，在抑制乙醇產(chǎn)生條件下，酵母菌有良好的耐受性。為了顯著增加乙醇的滴度，使用含糖超過(guò)250gL的培養(yǎng)基

10、進(jìn)行VHG發(fā)酵，因?yàn)榇蠓鶞p少了放電，不僅節(jié)省了乙醇蒸餾時(shí)的能量消耗，而且也節(jié)省了酒槽處理時(shí)的能量消耗(Baietal.2008)。然而，當(dāng)在VHG條件和嚴(yán)格應(yīng)力條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵，特別是抑制乙醇濃度升高條件下，會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞的生存能力產(chǎn)生不利影響，造成發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)和更多未發(fā)酵的糖發(fā)酵(Ingledew1999)。酵母細(xì)胞會(huì)合成甘油這樣的保護(hù)性代謝物來(lái)應(yīng)對(duì)應(yīng)力，減損乙醇產(chǎn)物中NADH，導(dǎo)致氧化還原的不平衡，使P控制更有效。4.1VHG乙醇

11、發(fā)酵中的P分布如圖三所示，釀酒酵母菌中VHG乙醇發(fā)酵的P分布圖類似浴盆(Linetal.2010)。當(dāng)酵母細(xì)胞被接種到新鮮培養(yǎng)基中，呼吸作用快速消耗了作為電子受體的溶解氧，使ATP增長(zhǎng)，從而P大幅降低。隨著溶解氧逐步減少，酵母菌代謝從有氧生長(zhǎng)切換到厭氧發(fā)酵產(chǎn)乙醇，在此期間，為了減少還原當(dāng)量NAD(P)H的消耗，促使甘油合成的許多途徑都被激活。此外，過(guò)量的葡糖糖底物，進(jìn)一步降低了P。由于糖的消耗，使得酵母生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵速度降低，酵母細(xì)胞的

12、裂解和相應(yīng)的氧化代謝產(chǎn)物釋放到環(huán)境中也使得P開(kāi)始增加。4.2P控制策略不像丁醇發(fā)酵工程已經(jīng)深入探索到對(duì)直接碳通量和高效產(chǎn)丁醇的電子流的菌株改良，酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)乙醇方面類似的研究卻是非常有限的，酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇方面的探索主要集中在在糖發(fā)酵過(guò)程中增加乙醇產(chǎn)量降低甘油產(chǎn)量，和從木質(zhì)纖維中通過(guò)戊糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇。近日，在VHG發(fā)酵條件下，提高酵母生存能力和增加乙醇產(chǎn)量的生物工程策略都得到了改進(jìn)。4.2.1菌株改良在發(fā)酵過(guò)程中，主要副產(chǎn)物甘油會(huì)和乙醇競(jìng)